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[求助]检测单个碱基突变的PCR条件如何优化？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-10-11 17:14    作者: WHO?    来源: 分析测试百科网

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[求助]检测单个碱基突变的PCR条件如何优化？
[求助]检测单个碱基突变的PCR条件如何优化？


本人用PCR方法检测糖尿病小鼠的db基因，该基因的一个碱基由正常的G突变为T，设计两对引物，其中一端为共同引物，而另一端引物的3'端分别为G和T（其它部分相同），通过这两对引物做PCR来判断该小鼠的基因型是纯合子db/db、m/m（m是正常基因）还是杂合子db/m。目前的情况是结果不稳定，同样的样品和反应条件，有时候能扩出来，有时候又扩不出来，这样的话每次都要重复很多次PCR才能分析得到一个比较可靠的结果。希望大家来讨论讨论，看怎么来优化条件。
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  • wawa (2011-10-11 17:15:09)

    先用一对（2条）引物，50ul体系扩增，优化条件，然后用3条引物扩增计算Ct差判断突变型和野生型。

  • +田田+ (2011-10-11 17:15:27)

    ARMS引物的设计是关键,你可以在3'端的倒数第二位的碱基再引入一个错配以增加特异性,退火温度要尽可能的高,我也在做这个so-called allele-specific PCR有空交流一下吧  

  • 嗨皮 (2011-10-11 17:15:47)

    ZLMG提到的方法我也考虑过，理论上可以讲得通，但没有试过，不知道效果会怎样。请问你做的allele-specific PCR引物就是这么设计的吗？

  • wawa (2011-10-11 17:16:06)

    是的,许多文献也是这么做的

  • 假小子 (2011-10-11 17:16:27)

    我也做这个，大家可以交流一下！对于三楼讲的方法，据我的经验其缺点是条件很难确定，而且很难扩增。我一般难摸条件的一般用降落PCR，重复性好的就用简单的PCR就可以了，同时酶、mg、引物浓度要尽量的低，你看看效果怎么样。我也被这个东西折腾了很久，很累人的！

  • WHO? (2011-10-11 17:17:02)

    提到的和我的想法一致，理论上看起来很好很简单的东西，真正做起来未必容易，优化条件可能还是要费一番工夫。反正最后老板也不同意改条件，我也不用去尝试了。老板不管你累死累活，到时间交东西，只可怜我每次做PCR前都要祈祷一番。

  • 邀月 (2011-10-11 17:17:28)

    退火温度（Tm值）最关键

  • 眼药水~ (2011-10-11 17:18:06)

    那我建议你用尽量高点的退火温度，要么用降落PCR，效果不错的  

  • 扑啦啦 (2011-10-11 17:18:52)

    我觉得这个方法是不太稳定的，检测一个位点的差别光靠引物3'位最后一个碱基的不同成功率不高，倒数第二第三位的碱基也应该有所错配。
    为什么不试试ligation chain reaction?用高温连接酶理论上要比taq酶精确啊。如果想通过电泳看结果，可以在连接引物5'端加上通用序列，连接产物用通用引物进行PCR。

  • 蛐蛐儿 (2011-10-11 17:20:11)

    我觉得你可以考虑Taqman-MGB探针啊
    Taqman-MGB探针做这个最合适了
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