【求助】求助蛋白质双缩脲法测定详细步骤

最新回复

• 冰激凌 (2016-2-14 16:30:47)

  一）实验原理
  双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
  紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
  此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
  （二）试剂与器材
  1.试剂：
  （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
  （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
  2.器材：
  可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
  （三）操作方法
  1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
  2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
  cuturl('http://tong.dxy.cn/experiment/430/465/468/15904.htm')

• wawa11 (2016-2-14 16:31:09)

  免疫荧光技术FAT
  放射免疫法RIA
  免疫酶技术ELISA ,IMEA,EMIT

• 哈密瓜 (2016-2-14 16:31:38)

  测定棉籽蛋白的蛋白质含量用哪种方法好呀？我现在已经用了考马斯亮蓝法，可是结果与凯氏定氮法相差不少，所以想用一种简便快速的方法来测定

• 双子座 (2016-2-14 16:31:59)

  好像最常规的就是凯氏定氮和考马斯亮蓝法了吧？我只接触过这两种

• wawa11 (2016-2-14 16:32:18)

  主要是俩种方法数据相差太大，这样的话就没有说服力了

• 886爱 (2016-2-14 16:32:37)

  可以多看点文献，看看别人对你类似的东西是用什么方法测的～如果是选择其中一种，那你就选好了～两种误差大，有可能是其中一种有问题，另一种是好的呢～呵呵

• jishiben (2016-2-14 16:33:03)

  我想请问下楼主蛋白质提取率怎么样 我也是做这一块的 我现在遇到了一些难题~

• 大大 (2016-2-14 16:33:23)

  楼主还在走棉籽蛋白么？？？？