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【求助】测量蛋白质浓度的方法
最近投了一篇稿子,审稿人置疑了我测量蛋白质浓度的方法。【求助】测量蛋白质浓度的方法
我实验中用的是牛血清蛋白BSA,用磷酸盐配成的pH7.0缓冲溶液,用紫外吸光280nm测标准曲线,然后去测未知样浓度。
审稿人置疑这种方法和Bradford法或Lowry法,哪个更好?还指出我没有提供有根据的文献,说这种根据氨基酸测量蛋白浓度的方法不可靠。
本人化工的,对蛋白质这块了解不多,BSA只是作为一种模拟物系才用到的,希望高人指点!谢谢!
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最新回复
malong (2016-2-16 18:17:50)
rrra6 (2016-2-16 18:18:17)
今生如此 (2016-2-16 18:18:40)
今生如此 (2016-2-16 18:19:04)
大大 (2016-2-16 18:19:29)
aaby (2016-2-16 18:19:52)
yazi (2016-2-16 18:20:15)
n111 (2016-2-16 18:20:38)
买个5*的公司试剂,到时候直接加水加蛋白溶液五分钟搞定
wawa11 (2016-2-16 18:21:10)
灵敏度为什么低呢?
xiaoxiaoai (2016-2-16 18:21:37)
1.灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1ug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
2.测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。
3.干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是:
1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。
2. 仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1M的NaOH。(如同0.1M的酸干扰Lowary法一样)。
3. 标准曲线也有轻微的非线性,在0-1000ug/ml浓度范围内有较好线性。因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
BCA法特点: 1. 灵敏度高,检测浓度下限达到25μg/ml,最小检测蛋白量达到0.5μg,待测样品体积为1-20μl 。 2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响,可以兼容样品中高达5%的SDS,5%的Triton X-100,5%的Tween 20,60,80。 3. 在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。 4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。 5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响:EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mM
BCA法和Commassie法各有优势,在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用,以消除定量的误差。
wwwh (2016-2-16 18:22:00)
n111 (2016-2-16 18:22:24)
燕子@ (2016-2-16 18:22:49)
【求助】测量蛋白质浓度的方法