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标题:【求助】关于大肠杆菌诱导表达

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发表于 2016-2-16 22:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于大肠杆菌诱导表达

用的是pet29b，我的蛋白37度3h诱导后全部是包涵体，很明显，上清基本无。然后22度诱导11h后沉淀中没有目的蛋白，上清中少，但比之前要多。这是不是说明，我应该在37度和22度之间摸条件呢？还有我听说低iptg有助于降低包涵体，但是为何我觉得1mM的好像比0.1mM和0.02mM的好像上清中要多一点呢
还有就是，如果大体积诱导，多少升细菌液合适呢？
问题比较多，谢谢各位啦
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米西11米西[使用道具]
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发表于 2016-2-16 22:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
结果出来了，我给自己回个贴吧，试了26度和30度诱导，也没有包含体了，对比后发现还是22度低温诱导上清中比较多，于是大体积诱导时做了20度0.5mM诱导了16h，虽然不多，但结果还算满意，这样终于可以回家好好过年喽～～感谢大家了，以及努力了那么久的自己
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idea2011[使用道具]
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 小中大
听意思是为了上清蛋白多？我们都是要沉淀啊，听不懂
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发表于 2016-2-16 22:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 idea2011 于 2016-2-16 22:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
听意思是为了上清蛋白多？我们都是要沉淀啊，听不懂

哦哦，要沉淀的话需要复性吧，我们是要上清
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2016-2-16 22:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
22℃诱导11h时间有点短了，最好过夜，15h以上应该可以。诱导剂用量最好别太多，不然容易出现包涵体，根据情况可以适当调整一下。
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发表于 2016-2-16 22:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 viviwang1987 于 2016-2-16 22:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
22℃诱导11h时间有点短了，最好过夜，15h以上应该可以。诱导剂用量最好别太多，不然容易出现包涵体，根据情况可以适当调整一下。

我又做了26度30度过夜的，比较看，觉得22度0.5mM好像多一点，我打算用20度大体积诱导纯化，做完就可以回家啦，所以这一次挺重要的，你说的过夜是多少小时呢？如果我20度诱导的话，你觉得诱导剂浓度0.5合适不？时间14—16h？多谢啦
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 小中大


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原帖由 viviwang1987 于 2016-2-16 22:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
22℃诱导11h时间有点短了，最好过夜，15h以上应该可以。诱导剂用量最好别太多，不然容易出现包涵体，根据情况可以适当调整一下。

哦哦，刚注意你说的时间。再请问一下，his标签的，过柱的话，像我这种上清中蛋白少的，洗脱液15ml会不会出来的蛋白浓度就小，需要减少洗脱液的量吗
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2016-2-16 22:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 米西11米西 于 2016-2-16 22:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我又做了26度30度过夜的，比较看，觉得22度0.5mM好像多一点，我打算用20度大体积诱导纯化，做完就可以回家啦，所以这一次挺重要的，你说的过夜是多少小时呢？如果我20度诱导的话，你觉得诱导剂浓度0.5合适不？时间14—16h？多谢啦
...

20℃诱导，过夜一般超过15h就可以了，如果蛋白稳定性好的话可以适当延长时间，不过最好不要超过20h，不然很容易溶菌，而且氨苄抗性的菌种超过20h还容易长杂菌，会影响蛋白的质量和产量。0.5的诱导剂用量差不多了，如果条件可以的话也可以做几个梯度的浓度做比较。
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2016-2-16 22:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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原帖由 米西11米西 于 2016-2-16 22:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

哦哦，刚注意你说的时间。再请问一下，his标签的，过柱的话，像我这种上清中蛋白少的，洗脱液15ml会不会出来的蛋白浓度就小，需要减少洗脱液的量吗 ...

如果蛋白浓度低，可以想办法浓缩的，关键是洗脱液的用量能保证最大量的洗脱目标蛋白。
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发表于 2016-2-16 22:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
20℃诱导，过夜一般超过15h就可以了，如果蛋白稳定性好的话可以适当延长时间，不过最好不要超过20h，不然很容易溶菌，而且氨苄抗性的菌种超过20h还容易长杂菌，会影响蛋白的质量和产量。0.5的诱导剂用量差不多了， ...

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多谢啦，结果出来了，20度，0.4mM诱导剂16h，过柱后用了8ml洗脱液，第二天本来打算处理柱子，又加了5ml洗脱液，发现还有目的蛋白，浓度都不多，有些弱杂带，不过对我来说也算不错啦，开学再做时就用洗脱液多孵育时间，之前时间5min太短。谢谢你啦
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