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【求助】PCR扩出来的条带亮度很弱是什么原因?
从高GC%的细菌基因组中PCR扩增一个2500bp左右片段,电泳检测有目的条带、无杂带,但目的条带亮度弱,我增加了模板的用量但没有改善。【求助】PCR扩出来的条带亮度很弱是什么原因?
反应条件:
95度 5min
(95度 1min
60度 45sec
72度 3min)33个循环
72度 5min
请大家帮我出出主意。
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最新回复
F22 (2016-3-02 15:00:02)
1,加大镁用量
2,加大引物或者摸板用量,非必要不要用这种方法
3,采用降落PCR
对于楼主的问题,建议采用降落PCR,你的后23个循环,可以每循环降低退火温度0.2-0.3度,或者加大Mg的浓度
此外不要为了加大产量,就轻易的增加摸板用量,有的时候加大摸板用量也有可能抑制PCR,反而降低摸板用量或许可以得到更多的产量。
ladyhuahua (2016-3-02 15:00:54)
1. 模板的用量在你这种情况下应该和目的条带浓度关系不大——记得realtimePCR的原理图么,循环数够多时,目的片段的终浓度在不同模板量条件下相差不大;
2.首先考虑扩增效率问题,可用touch down PCR,除开头几个循环外,后面的退火温度降低一些,可提高扩增效率;
3.如果无效,建议使用两步法,95度 1min,(60-65)度 3min,可加入touch down 步骤;
4.不知道反应体系如何配置,应该是使用了GCbuffer吧?TaKaRa的GCbuffer(尤其是II)的确会降低一些扩增效率;
5.视你最终需要,如果是诊断目的,可多加一些Taq酶,也能增加扩增效率,但错配率和非特异扩增可能会增加。如果是克隆目的,其实目的条带暗一些很多时候并不影响最终实验结果。
有不当之处,请多批评。
bring (2016-3-02 15:03:22)
另外,请问jh_dxy,什么是两步法?
ququer787 (2016-3-02 15:03:56)
如果增加Mg离子浓度的话,需要增加多少的量?我用的是Takara RNA pcr kit(AMV)Ver.3.0试剂盒,50ul体系,MgCl2(25mM) 2ul.
vcve (2016-3-02 15:04:52)
66小飞侠 (2016-3-02 15:06:02)
谢谢楼上!
我的RT条件是:
30 度 60min
42度 30min
99 度 5min
5度 5min 一个循环
Total RNA 500ng/ul
PCR条件是:
94 度 2min 一个循环
94 度 30sec
56度 30sec
72 度 1min 30循环
72 度 5min
跑电泳条带不亮,如果用降落PCR的话,可以增加扩增效率吗?怎样使用降落PCR?
ququer787 (2016-3-02 15:07:39)
72 度 1min ?时间短了点。150sec试一试,你要P的2.5K长。
glass (2016-3-02 15:08:29)
谢谢!
我要P的不是2.5k长,而是408bp.我P的另外一个目的基因是685bp,条件同上,跑出的电泳挺好的.
yychen (2016-3-02 15:21:12)
另外,你的RNA质量如何?有没有DNA污染,两对引物都是在外显子区还是跨了内含子,这些都是RTPCR必须考虑的因素。
glass (2016-3-02 15:22:00)
这两个是同一批RNA,如果是RNA质量问题的话,那么685bp也应该扩的不好.我想现在改变一下RT-PCR的条件,看扩的怎么样.如果改变不行的话,那么就考虑是引物设计的不好.可是我现在不知道怎么改变反应条件,他们有说的要增加Mg离子浓度,或使用降落PCR,不知道有没有用过的,效果怎么样?
wiwi (2016-3-02 15:23:06)
touchdown就是头几个循环退火温度逐步降低,然后在较低退火温度条件下进行剩余循环。
我扩增的GC含量高的样品都用的是TaKaRa 的酶和GC buffer。天根的不大好用。
后来熟了,也为了省钱,就用DMSO代替GC buffer,效果不错,不过浓度要摸索一下,
TaKaRa 和GC buffer联用的就是一种Taq LA酶,记得就是专门扩增长片段用的,可以试一下。
junjie05 (2016-3-02 15:23:53)
redbutterfly (2016-3-02 15:24:29)
可以这样做,但是一般都要做个梯度稀释的,10-1000倍不等,但是这样产生突变的几率就增加了许多!
bring (2016-3-02 15:25:11)
touchdown就是头几个循环退火温度逐步降低,然后在较低退火温度条件下进行剩余循环。
我扩增的GC含量高的样品都用的是TaKaRa 的酶和GC buffer。天根的不大好用。
后来熟了,也为了省钱,就用DMSO代替GC buffer,效果不错,不过浓度要摸索一下,
TaKaRa 和GC buffer联用的就是一种Taq LA酶,记得就是专门扩增长片段用的,可以试一下。
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LA酶扩增的产量如何?听说还有一种pfx酶,那是什么呢?
eor (2016-3-02 15:45:53)
eor (2016-3-02 15:47:55)
能否具体解释一下做法。我就在作长片段的扩增。15kb。正为用什么酶发愁那。
我用的是TaKaRa PrimerSTAR HS DNA Polymerase.您说的TaKaRa是什么酶?
DDD (2016-3-02 15:49:42)
code No. : DRR02AG
在目录书上有,你打电话给公司,告诉他们编号就可以。
【求助】PCR扩出来的条带亮度很弱是什么原因?