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【求助】荧光定量 PCR扩增曲线异常,超奇怪
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扩增漂亮的是 标准品(含目的基因的质粒),起始荧光背景高的是样品(从肾脏用TRIZOL提RNA,反转录CDNA),用REAITIME产物跑了电泳,目的带 很亮且特异。并且这些模板都用普通PCR检测均有目的带,病毒含量应该很高的,难道是模板不纯抑制了。望各位前辈赐教,谢谢
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最新回复
wawa (2016-3-03 11:34:35)
REAITIME产物跑的电泳,最右为阳性对照
83977425.jpg
wawa (2016-3-03 11:35:06)
融解曲线结果,没有杂峰
wawa (2016-3-03 11:35:31)
分析可能 模板太浓,稀释10倍100倍1000倍,结果如图,稀释后有所转好,但CT值很大了,这样的结果可信吗?并且三者检测结果不成10倍梯度关系。待测得病毒含量低的样品稀释后其不测不出了(敏感性标准品为10*1拷贝数)
wawa (2016-3-03 11:35:53)
79978698.jpg
wawa (2016-3-03 11:36:10)
22026502.jpg
wawa (2016-3-03 11:37:36)
普通PCR电泳图
98948917.jpg
koook5695 (2016-3-03 11:38:00)
稀释后杂质也相应减少了,所以背景有降低,曲线背景和平台期区分得更明显些。其实Ct值在13~30之间都可以采用,只是模板浓度越低,样本稀释等问题越容易导致结果不准确。事实上,一般检测1000拷贝一下的样本,使用realtimePCR的染料法要慎用了。
在园子里检索一下,类似的问题有好多。
wawa (2016-3-03 11:39:01)
稀释后杂质也相应减少了,所以背景有降低,曲线背景和平台期区分得更明显些。其实Ct值在13~30之间都可以采用,只是模板浓度越低,样本稀释等问题越容易导致结果不准确。事实上,一般检测1000拷贝一下的样本,使用realtimePCR的染料法要慎用了。
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