用Primer设计的7个NONE的引物也不见得就是万能的，当然了，它至少考虑了引物设计的几个关键－－－fp和 rp长度最好控制在18－25个base，Tm值相差小与5，GC含量相差小与10％。但另一方面，引物的基因特异性却要靠自己来把握，注意3｀端的5个碱基一定要保守，建议用BlockMaker服务器进行特异性验证。其实引物设计无非是解决两个矛盾，即PCR可行性与基因特异性之间的矛盾，二者很难兼顾，所以只要找到最佳平衡点就行了，没有完美的Primer pairs，只有现实可行的idea和protocol,Try U Best And U Will Make It
推荐Primer5，DNAStar，Oligo 6三个软件联用，再借助BlackMaker服务器验证。Good luck:）
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remenb (2016-3-03 11:53:10)
QUOTE:
可以的！莲花白 (2016-3-03 11:53:27)
但是，如果上下游引物长度相差太远，并不利于扩增反应的进行。这一点可以从primer5.0中的引物评分可以看出来。
因此，除非迫不得已，我建议你将两条引物长度设计的相近，这样引物评分要高一些。也有利于扩增反应的进行。
shenkunjie (2016-3-03 11:54:01)
上下游引物长度可以不同
主要是两条引物的Tm值要接近
不然会降低扩增效率
ququer787 (2016-3-03 11:54:42)
66小飞侠 (2016-3-03 11:54:56)
可以不同，但长度都要在18~30bp之间，TM之差最好不要超过10度
bhka (2016-3-03 11:55:12)
youyou99 (2016-3-03 11:55:29)
推荐Primer5，DNAStar，Oligo 6三个软件联用，再借助BlackMaker服务器验证。Good luck:）
831226 (2016-3-03 11:55:45)
join (2016-3-03 11:56:00)
请教一下，我现在需要在蟾蜍中检测是否存在一个基因（基因是未知的），它的同源基因在牛蛙和北极豹蛙中有，我想知道我的引物该怎么设计？拜托各位了，很急的
8黑眼圈8 (2016-3-03 11:56:26)
Blocker Maker 的网址如下：
cuturl('http://blocks.fhcrc.org/blockmkr/make_blocks.html') 主要功能是计算多个同源氨基酸序列的共有保守框（我认为这与生物信息学参考书上模体 （motif） 的概念十分相似。计算好的保守框当然是选择基因特异性引物的最适区段。
直观的结果如下图所示（我研究的蛋白有两个Motifs)
另外在分析结果里不要忽视了Coden Hope （名字即得不很清了）功能，它可以帮你设计出一种很奇怪的引物，3｀端保守，5｀端间并，引物长度都长于30bp，甚至可到60bp,我曾经试过这种引物，扩增条带不象正长PCR那样“漂亮”，但至少从新物种中克隆出了想要的片段，这为后续的RACE打好了基础。
还有两点体会 ：
:8)设计好的基因针对性引物最好在NCBI－Blast中用search for short nearly match工具验证一下他的特异性，一般情况下一对引物只要有一条的特异性较高的话，就不妨开始P了。当然了，反向引物验证时别忘了要拿他的互补序列。
:8)coden hope 设计的引物较长,所以退火温度一般稍高,建议适当调低一点,具体低多少,要自己摸索,其实正规情况下PCR反应多个条件都需自己优化,Mg离子浓度,Primer浓度，模板量等等，总之要有perfect的结果，就要double check,double efforts.
Good Luck
59737562.jpg
2541 (2016-3-03 11:56:41)
wiwi (2016-3-03 11:56:54)
如果是从噬菌体文库的阳性克隆做为模板，其中的插入片段未知，如何设计引物
wiwi (2016-3-03 11:57:16)
请问如果我想从CDNA中扩一段1.9kb片段，想要拿全长，（不做RACE），能不能做，如何设计引物，多谢指点！！！
【求助】pcr引物问题