[求助]各位专家，请过来看看，我没法解决这个问题了

最新回复

• =菓子= (2011-10-19 15:02:09)

  主要是因为你加样量不准确导致的
  做个体系标准管后,再分装到各个EP管中可以消除加样不准的问题.

• （cat） (2011-10-19 15:02:34)

  没有看出什么大问题啊，你的目的片段多长？以你的退火时间看，应该不会超过1kb吧。
  
  几点小建议：
  1. 我们作nest-PCR时，都是习惯将第一轮扩增产物取出2ul，稀释20倍，
  然后在第二轮中加1ul使用。我觉得你直接用1ul，量太多，有时模板太多也会抑制扩增的；
  2. 扩增不佳时，Taq的用量可以增加一下，比如，50ul体系用Taq 2.5U
  3. 你的第二轮中引物浓度以及退火温度是否有点高呢？
  
  good luck！  

• bs4665 (2011-10-19 15:03:12)

  我的电泳中从左至右，泳道分别为1、2、3、4、5、6，其中1号和2号是同一标本，3号和4号是同一标本，5号和6号是同一标本，奇怪的是2号和4号有阳性条带，而相对应的1号和3号却没有！我现在扩增一直碰到这样的现象。如果楼上战友所说的是我第二轮加样时直接加1ul量太多，但我不明白的是为什么同一标本的两个管有的能扩出来，而有的却不能？另外，我可以排除个人加样的原因，因为我曾用同一标本做了4个复管，同时扩增，结果是2阳性，2阴性。

• bs4665 (2011-10-19 15:05:29)

  刚用第一轮扩增产物稀释后再次扩增第二轮，结果还是一样，估计不是因为我没有稀释就直接将第一轮扩增产物1ul作为第二轮扩增的模板造成我的不稳定的原因。同时我的第二轮退火温度也降到54度了。可还是不行。
  各位专家，请帮帮忙吧！我真的不知道该怎么办了！

• 菠萝菠萝蜜 (2011-10-19 15:05:56)

  是不是可以请别人帮你做一下同样的PCR操作，如果别人做出来的是稳定的话那就是你操作哪里有问题了，可能你自己没意识到，不好意思个人意见。

• mamamiya (2011-10-19 15:06:23)

  是不是可以请别人帮你做一下同样的PCR操作，如果别人做出来的是稳定的话那就是你操作哪里有问题了，可能你自己没意识到，不好意思个人意见。

• 韩梅梅 (2011-10-19 15:06:47)

  第二轮摸板浓度太高了，建议稀释10－20倍

• smile_smile (2011-10-19 15:07:23)

  我认为可能还是你个人操作上的问题，最好不要微量加样，不然会造成反应体系是各组份误差太大，应该先稀释或配成混合液，减少不同样本间的误差。

• 不懂 (2011-10-19 15:08:15)

  什么时间加酶？因为你有个95度的预变性，是否在这之后？什么方式?我以前的操作在这一步出现过问题

• bs4665 (2011-10-19 15:09:09)

  我在95度预变性前加的，在配PCR mix时一起加到体系里面去了，同一标本做的复管，有的可以出来，有的出不来。也有试过用hot-start，预变性后加酶，同样没有效果。yu郁闷ing！