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[求助]RT-PCR结果只有引物二聚体，祈求大虾指教

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-10-20 13:23    作者: birdfish    来源: 分析测试百科网

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[求助]RT-PCR结果只有引物二聚体，祈求大虾指教
[求助]RT-PCR结果只有引物二聚体，祈求大虾指教


我一直在做外周血的RT-PCR，用GAPDH作内参扩的很好，因此自认RT过程没有问题；但是p目的基因一直不出，即没有目的条带，连非特异产物也没有，p了几次均为引物二聚体，做退火温度梯度（50-60度）也是什么都没有，（哪个温度都没有东东啊！），镁离子梯度也做了，一片黑暗！
我作的是20ul体系：ddH2O 7.6ul, 10*buffer 2ul, 25mM MgCl2 1.4ul, 10mM dNTP 0.8ul， 10uM引物 各2ul, 5U/ul Taq 0.2ul, cDNA 4ul (RNA 0.5-1.0ug 逆转录成cDNA 25ul ), PCR的条件如下：94度5min, 94度30s, 55度30s, 72度1min, 30 cycies, 72度7min.
我p的目的基因大小366bp，原文献的条件是94度5min, 94度1min,55度1min,72度2min, 30 cycies, 72度10min,我也作过，什么都没有。问题出在哪里呢？
我怀疑我要p的基因是否存在二级结构之类的，不好p？或者我采用的文献提供的引物设计不合理？哪位高手可以教我或帮我看看我的引物行不行？我的引物序列：CYP 2E1: sense, AGC ACA ACT CTG AGA TAT GG (925–944);
Antisense ATA GTC ACT GTA CTT GAA CT (1271–1290)；
还有，按照基因公司提供的Tm值，较低的在49度，可文献提供的退火温度为55度，我按照一本教材上的引物Tp=22+1.46有效长度（有效长度=2（G+C)+(A+T))计算较低的退火温度为61.4度，那么适宜的退火温度就应在56.4度左右，所以我在梯度p不出的情况下，还是采用了55度作为退火温度，我这样做对不对呢？
我已经摸了快一个月了，dNTP、Taq酶、ddH2O、buffer和镁离子都换过了，同实验室的战友作的都挺好，就我不行，我快急死了。还请各位大虾不吝赐教，小女子先行谢过了！
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  • #黄药师# (2011-10-20 13:24:13)

    问题可能出在引物合成上了。试试排除引物合成是否有错。

    不过你下次抽RNA小心一点咯。  

  • birdfish (2011-10-20 13:24:58)

    我采用52度10cycle 和55度30cycle，cDNA模板4ul，可以扩出很淡的带，但是再用该产物为模板取4ul，PCR条件94度5min,94度30s, 55度30s,72度1min,30cycle, 72度7min,所出的条带亮度没什么变化，有谁能告诉我这是为什么？如果是基因表达量低，第一次扩的有很淡的特异性条带，第二次扩带应该很亮才对，（因为我没有稀释），而 我 做了好几次都是这样的结果，是什么原因？请高手们抽空看看好吗，

  • mamamiya (2011-10-20 13:25:35)

    1.试试改变一下模板的浓度，模板浓度太大太小，都没有PCR产物。
    2.模板有没有降解？
    2.引物设计是否合理？
    4.引物合成是否正确，可以再其他公司合一对看看？
    5.该基因是否存在？

  • birdfish (2011-10-20 13:26:28)

    1.  试试改变一下模板的浓度，模板浓度太大太小，都没有PCR产物。

    我在20ul的体系中用过2ul和4ul的cDNA模板量，cDNA模板转自0.5-1ug总RNA/25ul RT体系，cDNA浓度没测过，但是同样用2ul和4ul的cDNA模板扩内参和别人的IGF2目的基因都能扩出来。

    2.  模板有没有降解？

    我在RT之前跑1％琼脂糖电泳，可以看到清晰的18s 28s条带，5s较淡且模糊，亮度和宽度也可以，RNA应该没有降解；另外RT后扩内参很好，也在一定程度上说明RNA和cDNA的质量还行吧？

    3.  引物设计是否合理？

    我就是不知道我的引物设计是否合理，能否请Wlhbu 仁兄帮忙看看，教我怎样用软件分析，有没有免费的分析软件可以下载呢？

    4.  引物合成是否正确，可以再其他公司合一对看看？

    我想把能做的条件都摸一遍，实在没辙了，就得再找别家合成试试了，可同期在他家合的内参的引物就很好用，所以我没敢贸然怀疑引物的问题。

    5.  该基因是否存在？

    我查了一些文章，这个基因已经有不少人做过了，RT-PCR虽然较少，但是也有几个，而且1篇QC RT-PCR检测的表达量在3.8*10(4)到2.6*10(5)molecules/ug total RNA，一般PCR应该能扩出来了。

    我今天又试了touchdown，annealing time从60-52度，每2cycle降1度，条件94度5min, 94度40s, 60-53度40s, 72度1min, 最后降到52度 25cycle, 72度10min, 4度 hold. 可是还是没有条带，连非特异的产物也没有，与阴性对照一样只有引物二聚体。这是怎么了？？麻烦各位战友再费心帮我找找原因吧。

  • 阿敏 (2011-10-20 13:26:57)

    在cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/')的blast中验证你的引物序列
    点击blast,选择nucleotide-nucleotide blast,在search中分行输入你的引物,点击blast
    再点format,等待.出现所有你的引物可以扩出的东西,找找是否有你的基因.
    另外,在摸条件时也有捷径,我用的是天为时代公司的PCR优化试剂盒,它有8种不同的buffer,一次就可以摸8个条件.试试吧.祝你好运!

  • birdfish (2011-10-20 13:28:02)

    我在合成引物之前已经在ncbi上blast过了，引物与源序列同源性100％，应该没错。但是我不知道怎样分析待扩增序列是否有诸如二级结构等影响扩增效率的结构，引物的Tm值、发卡结构、影响错配的因素等是怎样分析的？你有没有免费的分析软件？可否请指教？
    你所说的“天为时代公司的PCR优化试剂盒”，有没有联系方式啊，8种不同的buffer 是摸镁离子的条件吗？

  • @STAR@ (2011-10-20 13:28:27)

    liuranhebei 这样的软件很多 primer premier,Oligo ...

    cuturl('http://member.netease.com/~hoyoyo/biochem/nalow.htm')

    好像站里也有  

  • birdfish (2011-10-20 13:29:06)

    我又用touchdown和 Booster PCR法做了2个样本，这次连阴性对照都出现了较亮的非特异扩增，指示剂附近的引物二聚体却不见了，阴性对照从加样孔处开始较亮，向下逐渐变淡，成均匀的弥散亮度过渡；而样本却是在400bp以下开始变亮，在比目的条代（366 bp）更低一些的位置亮度最高，后又变淡，也没有引物二聚体；
    条件touchdown：94c 5min , 60-50c -1c/2cycle ; 25cycle( 94c 30s, 50c 30s, 72 1min), 72c 7min ,4c hold
    Booster:1uM primer 2ul:4ul cDNA/20ul systerm 20cycle; 10uM primer 2ul/20ul systerm 30cycle. 94c 5min , cycle( 94c 30s, 55c 30s, 72 1min), 72c 7min ,4c hold
    开始我怀疑体系有污染，更换了所有成分，并新溶了引物，再作还是这样的结果，请问这是怎么回事？我该怎么办？

  • 荷塘青蛙！ (2011-10-20 13:29:52)

    遇到这样的情况实在是很麻烦,我也和你差不多的.我是扩的冠状病毒的一段基因,怎么也不行,同样的方法,对照却扩的很好.所以我怀疑是RNA抽提的质量不高,量太少,或者可能是这段基因发生了突变.
    你如果下次能扩出来的话能不能告诉我是怎么回事好吗?

  • www.1 (2011-10-20 13:30:59)

    建议还是先用primer primier等软件分析一下你的引物是否好使，
    你20ul体系用2ulcDNA模板是不是多了点？可以试试用1ul吧

  • www.1 (2011-10-20 13:30:59)

    建议还是先用primer primier等软件分析一下你的引物是否好使，
    你20ul体系用2ulcDNA模板是不是多了点？可以试试用1ul吧

  • #甜# (2011-10-20 13:31:19)

    你要的基因在什么情况下表达啊，或者这个状态没有表达啊，你可以做一个阳性对照，用这个基因表达最多的组织提RNA作一次RT-PCR试试。  

  • birdfish (2011-10-20 13:31:56)

    回： （建议还是先用primer primier等软件分析一下你的引物是否好使，你20ul体系用2ulcDNA模板是不是多了点？可以试试用1ul吧 ）
    我用primer primier和Oligo分析过我的引物，的确存在诸如hairpin,dimer,false priming等问题，但是我在ncbi上搜的引物同样有这些问题，是不是相应结构的 delta G不要太高（<9)就可以呢？我不太懂，请教了！！
    另外，我作过模板梯度，从1ul,2ul,4ul,8ul,12ul，发现还是2ul的条带较好。我想是我的RNA浓度较低吧。你用1ul的模板，总RNA或cDNA的浓度是多少呢？提取的总RNA的A260/A280是多少？

  • birdfish (2011-10-20 13:32:51)

    回： （你要的基因在什么情况下表达啊，或者这个状态没有表达啊，你可以做一个阳性对照，用这个基因表达最多的组织提RNA作一次RT-PCR试试。）
    在什么情况下表达是什么意思啊？我做的是一种代谢酶基因的mRNA，取材人PBMC，怎样检索该基因在什么情况表达呢？是指的分布的组织、生长阶段还是别的什么？我只是见到有国外文献这样做的（取材和方法），所以我就做了，不知我还该注意哪些问题？
    请赐教！！
    好像该基因在肝脏表达最多，那我有机会取点肝组织作个阳性对照吧。不过因为组织不好找，所以我想扩几个好的样本送去测序，回来和cDNA序列作个blast，应该也可以吧。或者我是不是可以买个人源肝组织的cDNA,作阳性对照呢？
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