[求助]哪位高手能帮忙看看我的引物？

最新回复

• 小困 (2011-10-22 17:08:34)

  那是官方给的引物，Tm值太高啦，能不能用？

• 小困 (2011-10-22 17:09:52)

  拜托帮忙看看吧，pm了好多都石沉大海，不应该很难吧！！

• 小困 (2011-10-22 17:10:33)

  Sfi I A 与Sfi I B之间是插入未知片段，想把它PCR出来

• 阿敏 (2011-10-22 17:10:56)

  再详细说说情况吧。你的上游引物对得上，下游引物找不见。

• 阿敏 (2011-10-22 17:11:23)

  上面的Lower Primer 我写倒啦，应该是ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC. 详细情况是这样的，这是一个Lamda噬菌体多克隆位点附近的序列，在Sfi I A 与Sfi I B之间插入一段未知序列，想通过PCR把它扩增出来测序，但第一次买的引物是博亚合成的Sequencing Primer，（上游 TCCGAGATCTGGACGAGC 下游 TAATACGACTCACTATAGGG）,都没有产物，只有一个200bp左右的引物多聚体，后来把引物跑电泳，下游引物看不见条带，我就想重新订对引物试试，文献上一家单位也用过同样的载体，不过它也没有选用clontech官方网站推荐的引物，而是选用upper
  CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTG Tm 75.9 LOWER ATTATGCTGAGTGATATCCCGCTT Tm 61.5   相差14度，我不知道能不能照搬，用Premier 5.0设计的引物一大堆，也没有和它们类似的， 不知道该选哪个好

• 韩梅梅 (2011-10-22 17:11:47)

  我给您提供些信息和建议，应该会有些帮助：
  1、我看了您上面的附图，公司有明确建议的测序引物，clontech应该是可信的，所以建议您用他们的引物。
  2、还有您也可以试试，在google上，直接输入您的引物序列TCCGAGATCTGGACGAGC或者CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT，可以直接找到很多的信息，有许多就是文献引用的（这2对引物都有不少的文献引用），也间接说明上面引物的可信度（因为我不知您具体的载体，所以要您自己鉴别，好像长的那对引物可以用于PCR扩增，测序应该也没有问题）。
  4、我现在知道您的实验目的，我想您可以先用多克隆位点2侧的酶切一下，看看这个片断大约有多长，好心里有个数（注意鉴别未知序列里可能存在酶切位点）。另外，如果为了知道它的序列的话，不需要PCR出来再测序，您就纯化好质粒，用clontech提供的引物中的一条直接测序就好了，不要加2条引物哟（可能是废话了）。
  我把有上面对引物出处的clontech的文献给您寄去（附有clontech的pTriplEx、Lamda TriplEx和Lamda TriplEx2的资料），自己查一下，就按照CLontech的说明去做没有问题。

• 小困 (2011-10-22 17:12:33)

  1,引物TCCGAGATCTGGACGAGC有发夹结构, 不应该是理想选择,我猜clontech之所以敢选用这个引物在于它配套使用的PCR buffer,PH>9, 因为很早以前我用建库剩下的一点PCR buffer做过, 虽然效果不漂亮但还是能看出亮带在1.2kb左右.
  2,我还真没试过这种检索手段,谢谢您提醒.
  3,我用的载体是Lamda TriplEx2, 但怎么也找不到相关的资料,我知道pTriplEx2是由Lamda TriplEx2转制的,只好用它的序列代替拉,我的信箱是 lixj521@sina.com
  麻烦您给我寄一下(最近越来越懒拉,不过让我找可能还找不到).
  4,您说的方法我试过, 可是我们这里没有利用氯化铯或甘油的超高速离心机, 噬菌体的纯化就打折扣了,噬菌体DNA的提取用甲酰胺抽提法, 手法粗糙了点,噬菌体48kb左右的DNA, 一跑胶竟是1.5kb~35kb的smear,其中2kb~3kb左右很亮,酶切后依然是smear,但亮带转移至700bp~1kb左右,不知何故. 按理说这是个很好的方法,可让我做成这个样子. 直接取噬菌体跑PCR似乎比较流行, 酶量又有限 ,后来就未重复酶切操作. 也试着用纯化噬菌体DNA作模板, 依然无结果.
  5, 说点题外话,不知道您了解不了解蛋白质转印的膜, 我用大肠杆菌表达噬菌体插入序列的蛋白,然后把蛋白质转印到安马西亚公司的ECL膜上,有结果,但信噪比不高,而且不稳定, 您能不能介绍一种比较适合做这种工作的膜?

• 韩梅梅 (2011-10-22 17:12:59)

  TCCGAGATCTGGACGAGC和TAATACGACTCACTATAGGG引物是测序引物，2个引物用来做PCR并不匹配，退火温度分别55.9和44.7，这样做PCR恐怕是有问题。
  那对长引物，有文献用来做PCR的，其中的一个：
  Contact: Gong Da-Wei
  Division of Endocrinology, Diabetes and Nutrition
  University of Maryland
  660 Redwood St, HH497, Baltimore, MD 21201, USA
  Tel: 410 706 1672
  Fax: 410 706 1622
  Email: dgong@medicine.umaryland.edu
  PCR PRimers
  FORWARD: CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT
  BACKWARD: AATACGACTCACTATAGGGCGAATTGG
  Seq primer: GTTGGTACCCGGGAATTC.

• 小困 (2011-10-22 17:13:20)

  谢谢，他的upper primer和clontech一摸一样，lower primer小有改动但tm值差13度，敢不敢用啊？
  Tm GC％
  FORWARD: CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT 78.6 61.5
  BACKWARD: AATACGACTCACTATAGGGCGAATTGG 65.6 44.4

• 韩梅梅 (2011-10-22 17:13:41)

  PCR的退火温度最终是受低退火温度的那条引物影响，就如水桶上的短模板决定了水的高度。相差13度不是什么问题。文献报导的引物退火温度这么高（有点奇怪），不过退火温度高没有什么坏处，您试试吧。

• 小困 (2011-10-22 17:14:13)

  CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT 78.6 61.5
  ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC 69.9 50.0
  clontech的pcr引物 tm相差 8.6度，但lower primer 有gcc发夹结构，可以考虑吗？

• 韩梅梅 (2011-10-22 17:14:35)

  不要光看你的GCC发卡，还有GGCC的3‘ dimer，还有下面的错配。
  另一方面看看引物的退火温度，都70度了，如果用高一些的退火温度，这些发卡、dimer、错配都不会形成，不过不要忘了热启动。
  
  上面引物的这些毛病都是设计引物中应该避免的，有的时候没有办法就只有增加退火温度了。

  
  15679969.jpg

• 小困 (2011-10-22 17:15:16)

  唉，那就是Clontech公司推荐的引物了，真不知道他们的技术人员怎么搞的。
  您看改改成吗，3'末端都减去2个
  FORWARD: CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTG 75.9 62.5
  BACKWARD: AATACGACTCACTATAGGGCGAATTGG 65.6 44.4  

• 韩梅梅 (2011-10-22 17:15:36)

  我觉得是好一点，退火温度还有75.9和65.6。没有3‘的dimer和错配了，我觉得为了抱歉起见，您可以用这对引物，不要在改动大了，因为有文献和clontech的引物做参照，他们这样设计可能有一定的原因。我以前也碰见过，针对载体的非编码区的引物设计的很好，结果测序的时候总有问题，可能和非编码区基因的特点有关。