[求助]帮忙分析引物

最新回复

• 阿拉蕾 (2011-10-24 14:28:09)

  几点意见：
  1、您的酶切位点和您的引物之间多了一个碱基，好像不必要。
  2、你的下游引物没有终止码。
  3、另外您再检查一下引物扩增的片断是否是完整的读框。
  4、引物不做评价了，自己看一下程序分析的结果。

  
  43386785.jpg

• 二丫头466 (2011-10-24 14:31:39)

  下游引物5端是ACT对应在mRNA上就是UGA终止密码，谢谢楼上的支持，还望其他高手多提意见。经费有限，不希望重来。另外，我要表达的，但未考虑Kozak序列行吗？兄弟先谢谢了！！ 急急！！

• 阿拉蕾 (2011-10-24 14:32:14)

  看见终止码了，primer 5自动从1开始算蛋白读框，害我以为TGA不在读框，抱歉。
  真核表达，如果有kozak，效率会高些。没有的话，也可以表达。不是必须，但最好带上。原核就不用了。
  
  An example of a Kozak consensus sequence (Kozak, 1987; Kozak, 1991; Kozak, 1990) is provided below. Please note that other sequences are possible (see references above), but the A at position -3 and the G at position +4 are the most critical (shown in bold). The ATG initiation codon is shown underlined. ANNATGG 。  

• youyou99 (2011-10-24 14:33:44)

  看见终止码了，primer 5自动从1开始算蛋白读框，害我以为TGA不在读框，抱歉。
  真核表达，如果有kozak，效率会高些。没有的话，也可以表达。不是必须，但最好带上。原核就不用了。
  
  An example of a Kozak consensus sequence (Kozak, 1987; Kozak, 1991; Kozak, 1990) is provided below. Please note that other sequences are possible (see references above), but the A at position -3 and the G at position +4 are the most critical (shown in bold). The ATG initiation codon is shown underlined. ANNATGG 。
  
  ===================================================================
  
  阿拉蕾，你好！我现在想表达一个融合蛋白，但目标蛋白的引物不知如何设计，请指点。序列在后贴着
  以下几点不甚明白：
  1、引物如何设计
  2、终止密码子是哪一个，查到的碱基位置cds:478是CTG而不是UAG UGA UAA
  3、引物设计时除去掉终止子（绿荧光蛋白在其后）及注意阅读框外，还有什么应该注意的
  4、我的KOZAK序列应如何设计？
  首次表达蛋白真是难为我了，也麻烦您 了。
  谢谢

• 阿拉蕾 (2011-10-24 14:34:46)

  我现在想表达一个融合蛋白，但目标蛋白的引物不知如何设计，请指点。序列在后贴着
  
  ===============================================================================================
  
  您重新发个帖子吧，把序列直接贴在上面，我们大家一起帮您看看。

• koook5695 (2011-10-24 14:41:31)

  我这也要做融合蛋白表达,各位看看该如何设计引物
  一.signal sequence
  1gattacaaag gctttaagca ggttagtgac gttttagtta tgtaacaata acattacagg
  61 acacccataa ttgtttcaat ccaacgacaa tcagagcgta atccttgtat ctccttaagg
  121 aaatcgctat acttatcttc gtagttaggg gatagctgat cgggtccgct aatgttatga
  181 aataaaattc ttaacaaaag cgctaacttc ggttatacta ttcttgcttg ataaattaca
  241 tattttatgt ttggaggaag aaagattatg caatcaagtt taaagaaatc tctttacttg
  301 ggccttgccg cattgagctt tgctggtgtt gctgccgttt caacgactgc ttcagctaag
  361 tcatacgcta ctgcaggtgc ctattcaacg ttaaagacgg acgctgctac tcgtaacgtc
  421 gaagctactg gtactaacgc tttatacacg aagccaggta ctgttaaggg tgctaaggtt
  481 gtcgcttcta aggctactat ggctaagtta gcttcttcaa agaagtcagc tgactacttc
  541 cgtgcttacg gtgttaagac cactaaccgt ggttcagttt actaccgtgt tgtaacgatg
  601 gatggcaagt accgtggtta cgtttatggt ggcaagtctg acactgcctt tgctggtggt
  661 atcaagtctg ctgaaacgac tactaaggct gatatgcctg cacgtactac tgggttctac
  721 ttaactgaca cttcaaagaa cactctttgg acggctccta agtacactca atacaaggca
  781 agtaaagtta gcctttatgg tgttgctaag gacaccaagt ttactgtaga tcaggctgct
  841 actaagactc gtgaaggttc attatactat cacgtaactg ctactaacgg tagtggtatt
  901 agtggttgga tttacgctgg taagggcttc agtactactg ctactggtac acaagtactt
  961 ggtggtctgt caactgataa gtcagttaca gcaaccaacg ataacagtgt taagattgtt
  1021 taccgtacga ctgatggcac tcaagttggt tctaacactt gggtaacttc aactgatggt
  1081 acaaaggcag gttctaaggt aagcgataag gccgccgatc aaactgctct tgaagcctac
  1141 atcaatgcta acaagcctag cggttacact gtaactaacc ctaatgctgc agatgctacc
  1201 tatggtaaca cagtttacgc tactgtttcc caagcagcta cttctaaggt cgctttgaag
  1261 gtctcaggga ctcctgttac tactgcattg actacagctg atgctaatga taaggttgca
  1321 gctaacgata ccactgctaa tggtagttct gttgcaggct caacagtcta tgctgctggt
  1381 actaagttgg ctcaattaac aactgacttg actggtgaaa agggtcaagt tgtcacatta
  1441 actgccatcg atactgattt ggaagacgct acgttcactg gaactacgac ttactattca
  1501 gatcttggta aagcatacca ctacacttac acttacaata aggacagtgc tgcttcttca
  1561 aatgcaagta cccaatttgg ttcaaacgtc actggtactt taactgctac ccttgttatg
  1621 ggtaagtcta ctgctactgc taacggtact acttggttca actaataatt attatttagg
  1681 tgagctttgt tgataaaaag gtcttttcaa cgtttatgtt ggggagacct ttttatattg
  1741 aaaaaattag gcctttgtta gga
  signal peptide: 268~357
  二.vp3 gene sequence
  1 ctcattggag ggttcgttcg ttcgaaccag ccaatcaggg gagggggaag tgacgcaagt
  61 tccggtcaca tgcttccggt gacgcacatc cggtgacgta gttccggtca cgtgcttcct
  121 gtcacgtgtt tccggtcacg tgacttccgg tcatgtgact tccggtgacg tgtttccggc
  181 tgttaggttg accacgcgca tgccgcgcgg tcagcccaat agttaagccg gaaacacgtc
  241 accggaagtc acatgaccgg aagtcacgtg accggaaaca cgtgacagga agcacgtgac
  301 cggaactacg tcaccggatg tgcgtcaccg gaagcatgtg accggaactt gcgtcacttc
  361 cccctcccct gattggctgg ttcgaacgaa cgaaccctcc aatgagactc aaggacaaga
  421 ggatattttg cgcgccagga agtgacgtgc aatgccaccc tatataagcc aggaaacttc
  481 cggtttagtt cattcgttac tctgctctca gagagaacgg acctcaggtc ggagagatgg
  541 cactttctag gcctcttcag atttcttctg ataaattcta tgaagttatt attagattat
  601 catcggatat tgatcaagat gtccccggtc tgtctcttaa ctttgtagaa tggctttcta
  661 ccggagtttg ggagcccacg ggcatctgga acatggagca tgtgaatcta ccgatggtga
  721 ccttggcaga gaagatcaag aacattttca tacaaagatg gaatcagttc aaccaggacg
  781 aaacggactt cttctttcaa ctggaagaag gcagtgagta cattcatctt cattgctgta
  841 ttgcccaggg caatgtacgg tcttttgttc tcgggagata tatgtctcag ataaaagact
  901 ctatcataag agatgtatat gaagggaaac aaatcaagat ccccgattgg tttgctatta
  961 ctaaaaccaa gaggggagga cagaataaga ccgtgactgc agcatacata ctgcattacc
  1021 ttattcctaa aaagcaacct gaactgcaat gggcctttac caatatgcct ttattcactg
  1081 ctgctgctct ttgtctgcaa aagcggcaag aattgctgga tgcatttcaa gaaagtgatt
  1141 tggctgcccc tttacctgat cctcaagcat caactgtggc accgcttatt tccaacagag
  1201 cggcaaagaa ctatagcaac cttgttgatt ggctcattga aatggggata acatctgaga
  1261 agcaatggct cactgagaac cgagagagct acagaagctt tcaagcaact tcttcaaata
  1321 atagacaagt gaaagctgca ctggaaaatg cccgtgctga aatgttattg acaaagactg
  1381 caactgatta cctgatagga aaagaccctg tcctggatat aactaagaat agggtctatc
  1441 aaattctgaa aatgaataac tacaaccctc aatacatagg aagtatcctg tgcggctggg
  1501 tgaagagaga gttcaacaaa agaaacgcca tatggctcta cggacctgcc accaccggga
  1561 agaccaacat tgcagaagct attgcccatg ctgtaccctt ctatggctgt gttaactgga
  1621 ctaatgagaa ctttcctttt aatgattgtg ttgataaaat gctgatttgg tgggaggagg
  1681 gaaaaatgac taataaggtt gttgaatctg caaaagcaat tttgggaggg tctgctgtcc
  1741 gggtagacca gaaatgtaaa ggatctgttt gtattgaacc tactcctgta attattacta

• koook5695 (2011-10-24 14:41:49)

  1801 gtaatactga tatgtgtatg attgttgatg gcaactctac tacaatggaa catagaatac
  1861 cattagagga gcgtatgttt caaattgtcc tatcacataa attggagcct tcttttggaa
  1921 aaatttctaa aaaagaagtc agagaatttt tcaaatgggc caatgacaat ctagttcctg
  1981 ttgtgtctga gttcaaagtc cgaactaatg aacaaaccaa cttgccagag cccgttcctg
  2041 aacgagcgaa cgagccggag gagcctccta agatctgggc tcctcctact agggaggagt
  2101 tagaagagct tttaagagcc agcccagaat tgttctcatc agtcgctcca attcctgtga
  2161 ctcctcagaa ctcccctgag cctaagagaa gcaggaacaa ttaccaggta cgctgcgctt
  2221 tgcatactta tgacaattct atggatgtat ttgaatgtat ggaatgtgag aaagcaaact
  2281 ttcctgaatt tcaacctctg ggagaaaatt attgtgatga acatgggtgg tatgattgtg
  2341 ctatatgtaa agagttgaaa aatgaacttg cagaaattga gcatgtgttt gagcttgatg
  2401 atgctgaaaa tgaacaataa agatgactca aagcagatat gtctactttt ttagattctt
  2461 ttgaagagtg gtatgagact gcagccgcct cgtggcggaa tctgaaagct ggagcccctc
  2521 agccaaaacc aaaccagcag tctcagtctg tgtctccaga cagagaaccc gaacgaaaag
  2581 ataataatcg gggctttgta cttcctggct ataagtatct tgggcctggt aacggcctgg
  2641 ataaaggccc acctgtcaat aaggcggaca gcgtcgcgct tgaacacgac aaggcctatg
  2701 accagcagct taaagcggga gacaacccat atataaaatt caatcacgct gaccaggact
  2761 ttatagatag cctccaagac gaccagtcat tcggaggtaa tcttggaaag gctgtatttc
  2821 aggccaaaaa acgtatctta gagccatttg gcctagtaga agatcctgtc aacacggcac
  2881 ctgcaaaaaa aaatacaggg aagcttactg accattaccc ggtagttaag aagcctaaac
  2941 ttaccgagga agtcagtgcg ggaggtggta gcagtgccgt acaagacgga ggagccaccg
  3001 cggagggcac cgaacctgtg gcagcatctg aaatggcaga gggaggaggc ggagctatgg
  3061 gcgactcttc agggggtgcc gatggagtgg gtaatgcctc gggaaattgg cattgcgatt
  3121 cccaatggat gggaaacaca gtcatcacaa agaccaccag aacctgggtc ctgccaagct
  3181 acaacaacca catctacaaa gcaattacca gcggaacctc tcaagatgca aatgtccagt
  3241 atgcaggata cagtaccccc tgggggtact ttgatttcaa ccgcttccac tgccacttct
  3301 cccctagaga ctggcagaga cttatcaaca accattgggg aatcagaccc aagtctctta
  3361 aattcaagat cttcaatgtc caagtcaaag aagtcacaac gcaggatcag acaaagacca
  3421 ttgcaaacaa tctcacctca acaattcaag tctttacgga tgatgagcat caactcccgt
  3481 atgtcctggg ctcggctacg gaaggcacca tgccgccgtt cccgtcggat gtctatgccc
  3541 tgccgcagta cgggtactgc acaatgcaca ccaaccagaa tggagcacgg ttcaatgacc
  3601 gtagtgcatt ctactgctta gagtacttcc ctagtcagat gctaagaaca ggcaacaact
  3661 ttgagttcac atttgacttt gaagaagttc ctttccatag catgttcgct cattcacagg
  3721 acttagacag gctgatgaac cccctagtgg atcaatacct ctggaatttc aatgaggtag
  3781 acagcagcag aaatgctcaa tttaaaaagg ctgtgaaagg ggcttatggc accatgggcc
  3841 gcaattggct gccaggacct aaattcctgg atcaaagagt tagggcctac acaggaggaa
  3901 cagacaacta tgcaaactgg aacatctgga gtaatgggaa caaggtgaat ttgaaagaca
  3961 gacagtatct cctacaaccc ggacctgtgt cagctactta cacagaaggg gaggcttcca
  4021 gccttccagc tcaaaatatt ttagggatag ctaaagatcc atacagatca ggcagcacta
  4081 cagcaggaat aagtgacatt atggtcacgg aagaacaaga agtagcacct acaaatggag
  4141 tagggtggaa accatatggt aggactgtaa cgaatgaaca aaacactact acagctccta
  4201 caagttcaga tctggatgtt cttggagctt taccaggaat ggtttggcag aacagggata
  4261 tatatctgca gggacctatt ggggcaaaaa taccgaagac tgatggtaaa ttccatcctt
  4321 ctccgaatct cggaggattt ggcctgcaca atccaccacc gcaggtgttc atcaagaata
  4381 caccagtgcc tgcagaccct ccagtagaat acgtgcacca gaagtggaat tcctacataa
  4441 cccagtactc tacgggccag tgtacagtag agatggtgtg ggagctgaga aaagagaatt
  4501 caaagagatg gaacccagaa atccagttca ccagtaattt cagtaacaga acaagcataa
  4561 tgtttgcacc taatgaaact ggtggatatg tagaagatag attgattgga accagatatc
  4621 taactcaaaa tctgtaaatt ctgtgtaaaa attcaaataa agcacttcct ggcgcgcaaa
  4681 atatcctctt gtccttgagt ctcattggag ggttcgttcg ttcgaaccag ccaatcaggg
  4741 gagggggaag tgacgcaagt tccggtcaca tgcttccggt gacgcacatc cggtgacgta
  4801 gttccggtca cgtgcttcct gtcacgtgtt tccggtcacg tgacttccgg tcatgtgact
  4861 tccggtgacg tgtttccggc ttaactattg ggctgaccgc gcgcatgcgc gtggtcaacc
  4921 taacagccgg aaacacgtca ccggaagtca catgaccgga agtcacgtga ccggaaacac
  4981 gtgacaggaa gcacgtgacc ggaactacgt caccggatgt gcgtcaccgg aagcatgtga
  5041 ccggaacttg cgtcacttcc ccctcccctg attggctggt tcgaacgaac gaaccctcca
  5101 atgaga
  cds:3033~4637
  三. IL2 gene sequence
  1 aatactagca cagagacaac cagaacactg acaagatgtg caaagtactg atcttcagct
  61 gcctttcggt agtaatgctt atgactacag cttatggagc acctctatca gagaaaaatg
  121 acactcttac aactttaata aaagatttag aaaagctggg aacaagcatg aagaagatta
  181 atcttgagct ctacacacca aatgagaaac aggagtgcag ctggcaaact ctacaatgtt
  241 acttgaaaga aatagtcacc ttggagaatg aaattgaaga tgaggatgaa attgaagatg
  301 agaacgtatt tagtgttagg aatattgaaa agaatctcca aaaacttacg gacctaattc
  361 ccccaggaac gggatgcaag atctgtgaag ctaatgacaa gaaggagttt cctgaatttc
  421 accgagagct gaccaacttt ctgagatcta tgctaaaata agcagatgac catttatatt
  481 tttactgcta cgttatttat ttaagtattt aattacaaat aatttatata ttttaccctg
  541 gggctaacta acttgctgtc cattttggga ccactgtatg ctcttagtgt gggtgataac
  601 gtgtctgttc taagatcaca tttgatcctt tctgtaagcc ctacgggctc aaaatgtatg
  661 ttggaaaact aattggttct cactttgtca gtaaacttaa aatgacaact atttattgaa
  721 agaattgtta aaagttactt gtagatgata tttaataaat ttcagtaa
  cds:36~461
  我的设想是signal--vp3--IL2
  请大家来帮忙设计一下!谢谢!

• youyou99 (2011-10-24 14:43:03)

  source 1..1619
  /organism="Homo sapiens"
  /mol_type="mRNA"
  /db_xref="taxon:9606"
  /chromosome="17"
  /map="17q25"
  gene 1..1619
  /gene="BIRC5"
  /note="synonyms: API4, EPR-1, SURVIVIN"
  /db_xref="GeneID:332"
  /db_xref="LocusID:332"
  /db_xref="MIM:603352"
  CDS 50..478
  /gene="BIRC5"
  /note="apoptosis inhibitor 4; survivin;
  go_component: spindle microtubule [goid 0005876] [evidence
  E] [pmid 9859993];
  go_function: apoptosis inhibitor activity [goid 0008189]
  [evidence E] [pmid 9859993];
  go_process: G2/M transition of mitotic cell cycle [goid
  0000086] [evidence E] [pmid 9859993];
  go_process: anti-apoptosis [goid 0006916] [evidence E]
  [pmid 9256286];
  go_process: oncogenesis [goid 0007048] [evidence P] [pmid
  9256286]"
  /codon_start=1
  /product="baculoviral IAP repeat-containing protein 5"
  /protein_id="NP_001159.1"
  /db_xref="GI:4502145"
  /db_xref="GeneID:332"
  /db_xref="LocusID:332"
  /db_xref="MIM:603352"
  /translation="MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFI
  HCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFL
  KLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD"
  misc_feature 89..310
  /gene="BIRC5"
  /note="BIR; Region: Baculoviral inhibition of apoptosis
  protein repeat"
  /db_xref="CDD:smart00238"
  variation 626
  /gene="BIRC5"
  /allele="T"
  /allele="C"
  /db_xref="dbSNP:2239680"
  variation 1048
  /gene="BIRC5"
  /allele="T"
  /allele="C"
  /db_xref="dbSNP:1042489"
  variation 1479
  /gene="BIRC5"
  /allele="G"
  /allele="C"
  /db_xref="dbSNP:2856269"
  polyA_signal 1600..1605
  /gene="BIRC5"
  polyA_site 1619
  /gene="BIRC5"

• youyou99 (2011-10-24 14:43:45)

  ORIGIN
  1 ccgccagatt tgaatcgcgg gacccgttgg cagaggtggc ggcggcggca tgggtgcccc
  61 gacgttgccc cctgcctggc agccctttct caaggaccac cgcatctcta cattcaagaa
  121 ctggcccttc ttggagggct gcgcctgcac cccggagcgg atggccgagg ctggcttcat
  181 ccactgcccc actgagaacg agccagactt ggcccagtgt ttcttctgct tcaaggagct
  241 ggaaggctgg gagccagatg acgaccccat agaggaacat aaaaagcatt cgtccggttg
  301 cgctttcctt tctgtcaaga agcagtttga agaattaacc cttggtgaat ttttgaaact
  361 ggacagagaa agagccaaga acaaaattgc aaaggaaacc aacaataaga agaaagaatt
  421 tgaggaaact gcgaagaaag tgcgccgtgc catcgagcag ctggctgcca tggattgagg
  481 cctctggccg gagctgcctg gtcccagagt ggctgcacca cttccagggt ttattccctg
  541 gtgccaccag ccttcctgtg ggccccttag caatgtctta ggaaaggaga tcaacatttt
  601 caaattagat gtttcaactg tgctcctgtt ttgtcttgaa agtggcacca gaggtgcttc
  661 tgcctgtgca gcgggtgctg ctggtaacag tggctgcttc tctctctctc tctctttttt
  721 gggggctcat ttttgctgtt ttgattcccg ggcttaccag gtgagaagtg agggaggaag
  781 aaggcagtgt cccttttgct agagctgaca gctttgttcg cgtgggcaga gccttccaca
  841 gtgaatgtgt ctggacctca tgttgttgag gctgtcacag tcctgagtgt ggacttggca
  901 ggtgcctgtt gaatctgagc tgcaggttcc ttatctgtca cacctgtgcc tcctcagagg
  961 acagtttttt tgttgttgtg tttttttgtt tttttttttt ggtagatgca tgacttgtgt
  1021 gtgatgagag aatggagaca gagtccctgg ctcctctact gtttaacaac atggctttct
  1081 tattttgttt gaattgttaa ttcacagaat agcacaaact acaattaaaa ctaagcacaa
  1141 agccattcta agtcattggg gaaacggggt gaacttcagg tggatgagga gacagaatag
  1201 agtgatagga agcgtctggc agatactcct tttgccactg ctgtgtgatt agacaggccc
  1261 agtgagccgc ggggcacatg ctggccgctc ctccctcaga aaaaggcagt ggcctaaatc
  1321 ctttttaaat gacttggctc gatgctgtgg gggactggct gggctgctgc aggccgtgtg
  1381 tctgtcagcc caaccttcac atctgtcacg ttctccacac gggggagaga cgcagtccgc
  1441 ccaggtcccc gctttctttg gaggcagcag ctcccgcagg gctgaagtct ggcgtaagat
  1501 gatggatttg attcgccctc ctccctgtca tagagctgca gggtggattg ttacagcttc
  1561 gctggaaacc tctggaggtc atctcggctg ttcctgagaa ataaaaagcc tgtcatttc
  笑佛：我现在想表达一个融合蛋白，但目标蛋白的引物不知如何设计，请指点。序列在后贴着
  以下几点不甚明白：
  1、引物如何设计
  2、终止密码子是哪一个，查到的碱基位置cds:478是CTG而不是UAG UGA UAA
  3、引物设计时除去掉终止子（绿荧光蛋白在其后）及注意阅读框外，还有什么应该注意的
  4、我的KOZAK序列应如何设计？
  首次表达蛋白真是难为我了，也麻烦您 了。

• 阿拉蕾 (2011-10-24 14:44:19)

  1、引物如何设计？
  答：这个问题太大了，到园子里搜一下，直接输入“引物设计”，可以找到太多的介绍，有很多非常好，去看看吧，不要浪费这些资源。
  
  2、2、终止密码子是哪一个，查到的碱基位置cds:478是CTG而不是UAG UGA UAA
  答：在您的这个序列里，终止码是TGA，在Pubmed的这个网页，可以看见蓝色的超链接（CDS），后面有50-478，表明了读框从50到478，直接点CDS这个超连接，可以看到完整的cDNA （mRNA）序列。
  1 atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct
  61 acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag
  121 gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagact tggcccagtg tttcttctgc
  181 ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat
  241 tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa
  301 tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag
  361 aagaaagaat ttgaggaaac tgcgaagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc
  421 atggattga
  //
  
  3、引物设计时除去掉终止子（绿荧光蛋白在其后）及注意阅读框外，还有什么应该注意的
  答，单纯讨论和后面蛋白的连接，好像没有什么要注意的了。
  
  4、我的KOZAK序列应如何设计？
  在您的上游引物5'加保护碱基＋酶切位点＋kozak序列＋引物。

• youyou99 (2011-10-24 14:44:54)

  谢谢你的帮助，我现在还有一个问题，我想把上游的Bamh酶切位点换成Xba（TCTAGA），它能够满足kozak序列the A at position -3，对于the G at position +4好象大家都未解决这个问题，因为如果换成G，显然密码变了。我想问是不是我可以直接换了，保护碱基不用调整？

• 阿拉蕾 (2011-10-24 14:45:20)

  可以这样做。

• youyou99 (2011-10-24 14:46:02)

  关于引物设计的问题我主要是想问下游引物的设计。
  在构建融合蛋白时要求去除前一个蛋白的终止密码子，也就是说我的下游引物只能是：蛋白mRNA3’端的十几个碱基（去除终止子）--酶切位点--保护碱基。如果我用T载体连接的话，连酶切位点都不用设计，直接把mRNA 3‘端碱基（去除终止子后）反向互补重抄一遍就可以了。我上面的序列的下游引物以---gca gctggctgccatggat3’为准，反向互补重写即可。
  谢谢回答。

• 阿拉蕾 (2011-10-24 14:46:43)

  关于引物设计的问题我主要是想问下游引物的设计。
  在构建融合蛋白时要求去除前一个蛋白的终止密码子，也就是说我的下游引物只能是：蛋白mRNA3’端的十几个碱基（去除终止子）--酶切位点--保护碱基。如果我用T载体连接的话，连酶切位点都不用设计，直接把mRNA 3‘端碱基（去除终止子后）反向互补重抄一遍就可以了。我上面的序列的下游引物以---gca gctggctgccatggat3’为准，反向互补重写即可。
  谢谢回答。
  
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  是的。
  设计引物时，先不管修饰序列（就是保护碱基、酶切位点、kozak等等），只针对您的模板设计，引物设计好了，再在它的5‘加修饰序列。
  如果用T载体也要加酶切位点，否则麻烦。如果用载体上的位点，您还得考虑酶切位点是否匹配的问题，还有读框，最好设计酶切位点。