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[求助]pcr电泳结果紧急求教

字体: 小中大 | 打印发表于: 2011-10-24 17:51 作者: PINK 来源: 分析测试百科网

[求助]pcr电泳结果紧急求教

我从石蜡组织用常规酚－氯仿抽提法得到基因组DNA，经B球蛋白内参PCR证明提取成功，然后进行巢式PCR，下面依次为阳性对照、第一轮产物、第二轮PCR产物电泳图（100BP参照，第一轮产物应为290BP，第二轮大小应为173），[img][/img]求教我的结果是阳性吗？不好的原因是什么？可采取那些方法？

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[求助]pcr电泳结果紧急求教

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PINK (2011-10-24 17:51:46)

不好意思，还不会贴图
上面图片第1道为100bpmark,第2、3道分别为阳性对照第1、2轮PCR产物（第12轮取第1轮PCR产物5ul作为模板），第5-10道为110bp内参

下面第二张图第1道为100bpmark，第2-8道为不同样本第一轮PCR产物
第三张图第1道为100bpmark，第2-8道为不同样本第二轮PCR产物
PINK (2011-10-24 17:52:11)

重贴一下图，依次为1，2，3

20969844.jpg
PINK (2011-10-24 17:52:43)

2

48624438.png
PINK (2011-10-24 17:53:05)

3

67515733.png
PINK (2011-10-24 17:53:33)

我也请教了一下别人，我的第一轮的两个引物位置为
1、3370-3389
2、3659-3637　　　产物290

第二轮引物位置
3、3400-3419
4、3572-3552　　　产物173
　　
这样第二轮的时候，第一轮如果引物没用完，那么1、2分别和4、又会形成大小分别为202、159的产物，该如何区别和避免发生这种情况呢？
PINK (2011-10-24 17:53:58)

我的体系是
50ul
模板　　　　　　 5ul
buffer 　　　　　　　 5
dntp(2.5 each) 　　　　　　 4
Mg2+ 　　　　　　　 3
引物1 (2 OD用200uL水溶) 　1
引物2　　　　　　　　　　1
酶　　　　　　　　　　　0.5
水　　　　　　　　　　　30.5
红豆冰 (2011-10-24 17:57:24)

我帮你简单分析了一下，单单从软件分析这两条引物与你提供的序列的匹配情况来看，引物设计的质量还是很不错的（我用的分析软件是primer premier 5.0)，引物内部没有错配也没有发夹结构形成，引物间二聚体以及错误引发情况也不严重，Tm值非常接近在55C左右，GC含量也在可接受的范围。

blast结果如下（两条引物的情况相似，我拷贝了其中一条的比对结果）：
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
>gi|32307123|ref|NM_006534.2| Homo sapiens nuclear receptor coactivator 3 (NCOA3), transcript
variant 2, mRNA
Length = 7923

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.008
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Minus

Query: 1 tccttgctcttttatttgacg 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 463 tccttgctcttttatttgacg 443

>gi|32307125|ref|NM_181659.1| Homo sapiens nuclear receptor coactivator 3 (NCOA3), transcript
variant 1, mRNA
Length = 7935

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.008
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Minus

Query: 1 tccttgctcttttatttgacg 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 463 tccttgctcttttatttgacg 443

>gi|2584879|gb|AF016031.1|AF016031 Homo sapiens thyroid hormone receptor activator molecule (TRAM-1)
mRNA, complete cds
Length = 4668

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.008
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Minus

Query: 1 tccttgctcttttatttgacg 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 449 tccttgctcttttatttgacg 429
红豆冰 (2011-10-24 17:57:55)

>gi|2331249|gb|AF012108.1|AF012108 Homo sapiens Amplified in Breast Cancer (AIB1) mRNA, complete cds
Length = 6835

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.008
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Minus

Query: 1 tccttgctcttttatttgacg 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 458 tccttgctcttttatttgacg 438

>gi|2318005|gb|AF010227.1|AF010227 Homo sapiens receptor-associated coactivator 3 (RAC3) mRNA,
complete cds
Length = 4495

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.008
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Minus

Query: 1 tccttgctcttttatttgacg 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 343 tccttgctcttttatttgacg 323

>gi|2707769|gb|AF036892.1|AF036892 Homo sapiens nuclear receptor coactivator (ACTR) mRNA, complete cds
Length = 6754

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.008
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Minus

Query: 1 tccttgctcttttatttgacg 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 441 tccttgctcttttatttgacg 421
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

再把把这几条序列进行比对，它们之间的差别很小，我怀疑他们是不是同一个基因或者加工产物，只是命名不同？（这些基因的情况我不懂，如果确是同一种东西，你是不是考虑一下你所提的基因组或者mRNA的质量，再调整调整扩增的条件？）
一点拙见，仅供参考。
PINK (2011-10-24 17:58:29)

非常感谢你及时的答复，这对于我来说很重要！我的目的基因主要是在乳腺癌中表达，但文献中报道它在人体其他癌组织中如前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌，及子宫内膜癌中均有表达。目前我研究的是它在子宫内膜癌及正常子宫内膜中的表达，而且这对引物曾在乳腺癌组织中成功的测定了该目的基因的表达。但是，我应用它们测定该目的基因在正常及异常子宫内膜中的表达结果，十分不理想。琼脂糖电泳结果目的基因条带较弱，且能形成明显的二聚体。我很苦恼啊！另外我不知道我的目的基因表达率为何极低？这与文献报道不相符呀！郁闷啊！您能帮我分析一下什么原因吗？为盼！
#甜# (2011-10-24 17:58:46)

琼脂糖电泳结果目的基因条带较弱，且能形成明显的二聚体。

有没有试过升高退火温度？我做过，一般很奏效的。只要引物设计没问题。
101010 (2011-10-24 17:59:13)

而且这对引物曾在乳腺癌组织中成功的测定了该目的基因的表达。但是，我应用它们测定该目的基因在正常及异常子宫内膜中的表达结果，十分不理想。琼脂糖电泳结果目的基因条带较弱，且能形成明显的二聚体。

我不知道我的目的基因表达率为何极低？这与文献报道不相符呀！

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如果这对引物以前在乳腺癌组织中成功的测定了该目的基因的表达，那么你再调整一下PCR参数，比如njstevens 建议的升高退火温度。

我不太明白你说的“目的基因表达率为何极低？”，你是用普通的PCR方法来验证么？应该是提取mRNA，然后用标记探针做Northern blot来测定的吧。
PINK (2011-10-24 17:59:37)

我用的是RT-PCR，我说的目的基因表达率低是指出现阳性结果的样本数明显少于文献上报道的。而且njstevens推荐的方法我也试过，提高退火温度，二聚体是少了，可是目的基因条带也不见了，很困惑啊，会不会是我的引物真有问题呢？或者是文献报道有误？目前我们实验室很不具备做Northern blot的条件。我该怎么办呢？
=菓子= (2011-10-24 17:59:55)

要不你再重新设计一对引物试试 ?
PINK (2011-10-24 18:00:19)

我又做了几份标本，出了出人意料的结果，在500－700bp之间出现了明亮的条带，但那不是我的目的基因！我的目的基因应该是350bp,请教了实验室的老师，其说可能是DNA污染，让我验证一下我的目的基因组上下游引物之间有无内含子。可是我不知道基因库中序列是CDNA还是基因组DNA?请您指教！您认为是什么原因呢？非特异性扩增吗？另外还想请您帮我分析一下我新找到的一对引物，您能帮我比较一下其和前一个哪一个更好吗？多谢您了，请您及早回复，不胜感激！
AIB1-F primer (438-458)5-CGT CAA ATA AAA GAG CAA GGA-3-
AIB1-R primer (564-584)5-CAC CAC AAA TAG GAA ACC ATC-3-
另请各路英雄亦倾尽所知，多加指点！谢谢！
微笑的海豚 (2011-10-24 18:01:05)

我又做了几份标本，出了出人意料的结果，在500－700bp之间出现了明亮的条带，但那不是我的目的基因！我的目的基因应该是350bp,请教了实验室的老师，其说可能是DNA污染，让我验证一下我的目的基因组上下游引物之间有无内含子。可是我不知道基因库中序列是CDNA还是基因组DNA?请您指教！您认为是什么原因呢？非特异性扩增吗？另外还想请您帮我分析一下我新找到的一对引物，您能帮我比较一下其和前一个哪一个更好吗？多谢您了，请您及早回复，不胜感激！
AIB1-F primer (438-458)5-CGT CAA ATA AAA GAG CAA GGA-3-
AIB1-R primer (564-584)5-CAC CAC AAA TAG GAA ACC ATC-3-
另请各路英雄亦倾尽所知，多加指点！谢谢！

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不知你的问题现在解决了没有?
我帮你分析了一下，你提供的序列因该是cDNA, 基因定位在20号染色体－－chr20:45,564,028-45,717,934

这一对引物：
AIB1-U primer (5'-ATA CTT GCT GGA TGG TGG ACT-3'; sense; positions 110–130; GenBank accession no. AF012108)
AIB1-L primer (5'-TCC TTG CTC TTT TAT TTG ACG-3'; antisense; positions 458–438; GenBank accession no. AF012108);
在基因组序列有两个内含子，全部加起来有40kb,所以，你劈出的500－700bp条带不大可能是这段基因组序列。

你后来设计的引物质量不如这一对。

你的问题也请别的战友帮助分析分析。
PINK (2011-10-24 18:01:26)

非常感谢你的答复！我还是不太明白你的意思，我只是想知道
这一对引物：
AIB1-U primer (5'-ATA CTT GCT GGA TGG TGG ACT-3'; sense; positions 110–130; GenBank accession no. AF012108)
AIB1-L primer (5'-TCC TTG CTC TTT TAT TTG ACG-3'; antisense; positions 458–438; GenBank accession no. AF012108);之间是否跨越了内含子？请明示，万分感激！
131415 (2011-10-24 18:01:45)

这一对引物：
AIB1-U primer (5'-ATA CTT GCT GGA TGG TGG ACT-3'; sense; positions 110–130; GenBank accession no. AF012108)
AIB1-L primer (5'-TCC TTG CTC TTT TAT TTG ACG-3'; antisense; positions 458–438; GenBank accession no. AF012108);
在基因组序列有两个内含子，全部加起来有40kb

也就是说，如果用这一对引物直接从基因组里P，理论上会有40kb大小的产物，因为中间含有的两个内含子基本上就有这么长。