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【求助】请教大家反转录后PCR加多少模板cDNA的问题
各位高手请不吝赐教。。感激不尽。。。【求助】请教大家反转录后PCR加多少模板cDNA的问题
我做的RNA反转,现在提到的RNA浓度有1000ng/μl,然后用的TAKARA的反转试剂盒。
是要做荧光定量的,所以想先做个普通的PCR看看引物的效果。。。
请教大家用一个25μl的体系怎么样,怎么配比较好?。
我是新手。。。完全没有概念。。。
加cDNA模板的浓度要求是多少?
谢谢大家⊙﹏⊙b。
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最新回复
ending (2016-4-06 15:00:48)
逆转录的Buffer体系(主要是缓冲体系和镁离子)会影响后续PCR的Buffer 体系。
另外,配制PCR体系,每种成分的加样量不要低于1ul,不然实验重复性会非常糟糕了;引物和PCR成分可以事先预混,cDNA可以稀释后再加。
@STAR@ (2016-4-06 15:01:25)
QUOTE:
谢谢您的指点。。我是不是可以把除了 模板和taq酶之外的其他组分先配成MIX,然后分到每个管中?。。。我师姐说必须要按顺序一个一个的加。。。但是我觉得先混合成MIX没有区别啊SO2 (2016-4-06 15:02:21)
如果用相同的引物,可以把模板之外的所有成分预混,最好所有PCR成分都预冷,预混后放冰上。
在冰上操作是为了减少非特异性扩增,因为在低温时Taq酶的聚合活性较低。你师姐说的也有一定的道理:各成分绕PCR管加在壁上或者盖子上,最后离心混合,也是为了减少非特异性扩增。但是那样做的话加样误差太大,实验重复性不高。
@STAR@ (2016-4-06 15:02:57)
QUOTE:
谢谢你的指点。那混合后能不能涡旋一下?我听有人说有酶的都不能涡旋。。。但是我们一直都是涡旋一下再离心。。。F22 (2016-4-06 15:03:17)
shenkunjie (2016-4-06 15:04:06)
1000ng太高了,可以稀释成100ng/ul,然后加1ul就够了,甚至有人告诉我她用30ng也能扩出来,不过我一直用100ng
@STAR@ (2016-4-06 15:05:50)
QUOTE:
那么除了酶、模板之外其他的成分(buffer,mg,dNTP,水)先混起来做个Mix应该没有问题。对吧?any333 (2016-4-06 15:08:49)
33号 (2016-4-06 15:09:29)
谢谢
33号 (2016-4-06 15:10:15)
你好,我现在也正在做普通PCR,想检测在细胞中一种基因是否存在,我提了RNA后逆转录cDNA ,40ul 体系的,RNA我加了4000ng。在做普通PCR时,cDNA加入多少量合适? 多了是否会有影响?
yhtfyl (2023-2-24 08:46:33)
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