如何全面分析分子间相互作用2

测量热稳定性同样重要
蛋白质等生物大分子及其相关复合体系的稳定性研究是进行相互作用分析的重要基础之一。分子间相互作用在蛋白质分子内实际上就是蛋白质结构的稳定性和可折叠性。对于生物功能的信息流动而言，蛋白质天然结构的稳定性和可折叠性是一个重要环节。具有适当初级序列的多肽链折叠成具有生物活性的天然结构，使得从遗传信息到生物功能的信息表达过程得以完成。在正确的物理化学条件下，蛋白质的折叠是自发的；在不正确的物理化学条件下，蛋白质通常没有紧致而特定的结构，也就没有其生物学功能。
在这个意义上，我们说，基因一旦被表达，即被翻译成一定的多肽序列，热力学就代替生物学机制起主导作用，将原本是柔性、不规则的多肽链折叠为生物学功能所需的、更紧致、特定的结构。
下图反映了我们刚才所说的三个方面，即动力学、热力学和热稳定性。若想分析分子间相互作用，我们须全面地了解：分子间是否存在结合（相互作用），结合的快慢、结合的强弱，结合的机理、以及驱动力……
所有这些关于分子间相互作用的研究常常采用生物物理的方法来进行，目前应用的一些技术都需要提前对作用的分子进行标记处理，但标记的处理常常会导致分子不是处于真正的原位环境，而且标记的处理会带来其他无法预测的额外因素，为分子间相互作用的研究增加了难度。
来自GE医疗集团生命科学部的表面等离子共振技术（Biacore）和微量热技术（Microcal）却很好地克服这些缺陷，它们的特点是：非标记、原位、微小、灵敏、快速，动态的、全过程地实时、定量表征结合的过程；而且这二者技术得到信息的相互补充、相互印证可以为我们正确全面判定分子间相互作用的全面机制，提供充分的信心：不仅可定量研究结合的快慢（ka\kd），结合的强弱（Ka\G）；而且可定量研究结合的位点（n），结合的驱动力及机理（△G\△H\△S），并且可评判结合的稳定性。所有这些都十分有助于我们的生命科学研究工作者对生命本质的认识。

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三大技术平台
若想了解热稳定性和分子结构的热容，首选差示扫描量热仪DSC。该技术通过升高或降低温度来诱导高分子的改变，从而测量相互作用的热力学。过去该技术的使用仅限于少数专业科研小组，但现在的仪器使用简单，只需要适量的物质即可准确地测量，DSC也就成为大部分生物物理学实验室的常规仪器。
使用DSC，你能快速鉴定出最稳定的蛋白质和生物药物候选物；比较天然、修饰和突变异构体生物分子；在几天的时间内优化表达、纯化以及制造的工艺；并对各种液体剂型进行简单、快速的优化和确定。目前，已有成千上百的发表刊物中记录了蛋白质，核酸和脂质分子稳定性的DSC表征的结果。
表面等离子共振技术SPR是一项用于测定相互作用动力学和亲和力的技术。分子配体（蛋白质、核酸、脂质体、蛋白质膜、碳水化合物、小分子）被固定在传感芯片的金膜表面。芯片表面与微通道系统相连接，通过此通道，精确控制流速的缓冲液和样品流经配体分子固化的表面。固化的分子与在溶液中的样品（被分析物）能够在传感器表面检测到质量的变化，这种质量变化是通过表面电浆共振的现象SPR被检测到的。样品（被分析物）与配体的结合的相互作用直至达到平衡的随时间的变化过程被实时记录下来，在任何时间，样品可以被切换成单纯的缓冲液，则解离的过程就会随之而来。从一个或几个实验中得到的相互作用图谱，就可以确定配体分子与样品结合的亲和力、动力学、选择性、浓度以及热力学的信息。
等温滴定量热法 ITC 同样能提供大量的生物分子相互作用的追踪记录。该技术是以测定注入某种配体后含生物分子的样品池所释放或吸收的热量为基础，在众多研究中用于考察突变和溶液条件改变的影响，以获得对于相互作用背后的驱动力、驱动因素的全面理解。此外，ITC的应用也不仅限于结合的研究，该仪器还可用于测量和定量诸如酶促反应的任何热量改变过程。
ITC应用的一大优势在于其依赖的是热力学测定，因此采用ITC对天然生物分子进行鉴定的过程中无需引入任何的标记分子。并且该方法也没有分子量限制，同样对样品也没有光学透明的外观要求。ITC滴定对于研究单个实验的结合亲和力，结合焓以及相互作用的剂量效应尤其适用。

[ 本帖最后由 yunduo 于 2011-11-24 20:14 编辑 ]