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有哪些因素可以影响western-blot实验结果？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2017-12-22 09:21    作者: dealer    来源: 分析测试百科网

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有哪些因素可以影响western-blot实验结果？
1.        样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。
2.        凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。
3.        点样。样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。
4.        电泳缓冲液。尽量用新鲜配制的。这样能保证PH值和离子强度的稳定。
5.        电压条件。我们经常用的浓缩时80V，分离时100V比较好，条带很平。
6.        转膜。膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的可靠性。而如果所分离的蛋白需要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF膜才能经受住严酷的清洗条件。
7.        抗体杂交与底物显色。一抗尽量选择小鼠或者兔来源的单克隆抗体，还有要注意所用的抗体是否能够识别变性条件下的目标蛋白；二抗一般都是效价很高的，只要室温下杂交1小时就可以了，适当延长也是可以的。另外，要选择灵敏度较高的化学反应底物。如英格恩生物的超敏型ECL发光液Enlight-Plus，检测级别可达pg级，发光时间长，稳定。
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  • Kiwi2021 (2021-11-15 11:50:04)

    Western blot(蛋白印迹)作为科研研究中最为平常的实验，却蕴含了很多知识，https://1686990.com/view/uklotto8/klsf_index.html可谓是小实验里却有大文章。尽管绝大多数研究僧在接触该实验时都会被虐的体无完肤，却也在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少经验。正所谓前人种树，后人乘凉，现在小鱼就把各位前辈做WB的各种经验总结起来，希望对大家能有所帮助。

    WB的基本原理

    在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，https://1686990.com/view/zsh/index.html?lottype=sgAirship然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。依其原理，可分为两种方法：A、直接法和B、间接法。

  • Kiwi2021 (2021-12-20 11:39:13)

    Western blot(蛋白印迹)作为科研研究中最为平常的实验，却蕴含了很多知识，可谓是小实验里却有大文章。尽管绝大多数研究僧在接触该实验时都会被虐的体无完肤，却也在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少经验。正所谓前人种树，后人乘凉，现在小鱼就把各位前辈做WB的各种经验总结起来，希望对大家能有所帮助。

    WB的基本原理

    在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，cuturl('https://1686990.com/view/zsh/index.html?lottype=sgAirship')然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。依其原理，可分为两种方法：A、直接法和B、间接法。https://1686990.com/view/zsh/index.html?lottype=sgAirship
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