[求助]原代肝细胞培养

最新回复

• glass (2012-1-14 16:45:44)

  活率90%以上了，本身的方法和操作应该都没问题了。不贴壁有2个可能，细胞本身太老（这个可能性小），培养瓶或者培养基不好。
  从个人经验看，取出来的肝细胞很好贴壁的啊，直接拿个塑料瓶，或者培养板，很快就贴上去了。
  
  你还是把具体情况说下吧，好仔细分析。

• bohe221 (2012-1-14 16:46:57)

  
  培养基应该没问题，接种量也没问题。
  浑浊物，不知道是不是你的明胶的问题。你试着不包被，看看情况怎么样。还有就是肝细胞几个小时就可以贴壁，你到时间了看看。！

• glass (2012-1-14 16:48:08)

  活率90%以上了，本身的方法和操作应该都没问题了。不贴壁有2个可能，细胞本身太老（这个可能性小），培养瓶或者培养基不好。
  从个人经验看，取出来的肝细胞很好贴壁的啊，直接拿个塑料瓶，或者培养板，很快就贴上去了。
  
  你还是把具体情况说下吧，好仔细分析。
  
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  我培养基用的DMEM，胎牛血清10%，都是进口的，双抗也加了。接种量为1*106。培养瓶，培养板都是一次性的，而且也用明胶包过了。培养48小时后，培养瓶内有很多结块的混浊物，培养板底贴了一层比较厚的膜，一晃就掉下来了，变成了和培养瓶中一样的混浊物。请问您在北京吗？想现场看一下您是怎么做的。谢谢！

• nn255 (2012-1-14 16:50:53)

  我培养基用的DMEM，胎牛血清10%，都是进口的，双抗也加了。接种量为1*106。培养瓶，培养板都是一次性的，而且也用明胶包过了。培养48小时后，培养瓶内有很多结块的混浊物，培养板底贴了一层比较厚的膜，一晃就掉下来了，变成了和培养瓶中一样的混浊物。请问您在北京吗？想现场看一下您是怎么做的。谢谢！
  
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  我们用的是鼠尾胶原蛋白，杭州生友。效果比明胶好。希望能帮到你。

• hold住 (2012-1-14 16:51:32)

  
  我做的小鼠肝细胞原代培养，用的体外消化法，快2个月了，一直不成功，出现的情况和LZ说的一模一样！正准备改用两步灌注法呢！

• hold住 (2012-1-14 16:52:01)

  我们用的是鼠尾胶原蛋白，杭州生友。效果比明胶好。希望能帮到你。
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  看来你们培养的挺好喽！是做的小鼠吗？能否分享一下经验？

• nn255 (2012-1-14 16:52:41)

  看来你们培养的挺好喽！是做的小鼠吗？能否分享一下经验？
  
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  我们做的是小鼠，年龄大概在8-10周左右，体重25g左右为好！灌流采用的是两步法，用四型胶原酶消化！

• glass (2012-1-14 16:54:13)

  培养基应该没问题，接种量也没问题。
  浑浊物，不知道是不是你的明胶的问题。你试着不包被，看看情况怎么样。还有就是肝细胞几个小时就可以贴壁，你到时间了看看。
  
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  刚开始一直都没有包被，也是类似情况，所以才用明胶促进贴壁。请问您的贴壁原代肝细胞有图片吗？可否给看看是什么样子滴？谢谢~

• glass (2012-1-14 17:19:28)

  
  肝细胞就是圆圆的小亮点，一个个分散开的。
  但视野不不要有其他小黑点，或者红细胞，那样的话细胞不存做实验影响很大。
  
  p.s. 你们条件都比较好，应该不会出问题啊。我们做的时候都用胰酶消化，直接拿个瓶子或者板子就用了，有时候还是用的玻璃瓶。

• bohe221 (2012-1-14 17:19:57)

  肝细胞就是圆圆的小亮点，一个个分散开的。
  但视野不不要有其他小黑点，或者红细胞，那样的话细胞不存做实验影响很大。
  
  p.s. 你们条件都比较好，应该不会出问题啊。我们做的时候都用胰酶消化，直接拿个瓶子或者板子就用了，有时候还是用的玻璃瓶。
  
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  我今天换液，只剩下很少的细胞了，而且还有与死细胞结成团的，不知肝细胞是否还能再长？您的意思是还要纯化吗？

• glass (2012-1-14 17:20:16)

  
  肝细胞，如果消化前冲洗干净了的话，杂细胞只有红细胞的，用0.83%的NH4Cl洗到离心之后没有红色就好了。

• 阿敏 (2012-1-14 17:20:41)

  我做过，贴壁很好，就是存活率不高，大概60%多点

• yychen (2012-1-14 17:21:26)

  肝细胞，如果消化前冲洗干净了的话，杂细胞只有红细胞的，用0.83%的NH4Cl洗到离心之后没有红色就好了。
  我做的一直没有看见红细胞污染的。我说一下我的方法吧：肝门静脉进灌流buffer，下腔静脉出。还有就是要注意的是离心的速度，我一般是用的600g，1min。这样可以拿到细胞，同时可以避免其他细胞的污染。我把我自己写的protocol放在上面了，上面有buffer的配方和胶原酶的名字和用量。希望能帮到大家。

• @STAR@ (2012-1-14 17:22:00)

  
  我之前也遇到过瓶底有一层膜，一晃就掉下来这种情况，我在镜下看过，其实那层白膜就是细胞，只是细胞发生融合，并且有杂质。发生这种情况，就是细胞贴壁没贴紧。用多聚赖氨酸吧！
  我用多聚赖氨酸包埋的瓶子，效果很好，细胞都贴壁了。建议你试试。