[求助]人牙周膜成纤维细胞体外培养

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• qumm1985 (2012-2-02 13:00:44)

  回答：
  1、刮去牙周膜组织要使用锐利的手术尖刀片刮取，把刀片加到刀柄上，便于施力；
  2、刮的时候，用力，使劲刮，刮下来的组织很少，能出来的细胞也很少，所以接种到T25细胞培养瓶内，或者是6厘米培养皿内；
  3、试试看组织块法，个人感觉不错，你的那个胶原酶没有用过；
  4、原代培养后48小时观察一次，确定没有污染后，可以一周后换液再观察，不要频繁观察，来回晃动，环境剧烈变化都不利于细胞贴壁变形爬出；
  5、一周换液时考虑因为细胞数量少，左旋谷氨酰胺代谢1周差不多了，所以1周后可以考虑来个半量换液，我培养过人的，大概需要10天左右才有细胞爬出，要有耐心。

• tianmei001 (2012-2-02 13:01:30)

  
  没做过你那个，但是我们经常做原代皮肤成纤维细胞的培养，说说自己的看法
  1、 一般牙周膜的宽度在0.15-0.38mm左右，拔下的牙根上附着的就更少了，像这样的组织量较少是否有影响，怎样解决？？
  宽度在0.15-0.38mm左右应该是可以了，但是尽量多取组织，因为消化后细胞量过少，也是难以培养的
  2.胶原酶按0.2g/100ml配置，溶剂为pbs，可以吗？？
  我们一般直接用0.25%+EDTA+37度消化45-60分钟即可，牙周膜比较薄，应该很好消化。胶原酶作用比较弱，而且你配的浓度个人认为也比较低，怕是达不到消化组织的目的
  3.上述方法是否有不妥，或者有什么细节没有注意？？
  离心后应该去上清，加培养基重悬后吸出，再接种培养瓶
  4.还有别的吗？？
  组织消化培养应该还涉及细胞分离、培养和纯化的问题，没养过你那个，所以不知道你的细胞纯化怎么确立；另外，组织块培养法也是可以的，但是周期长，且容且污染。
  以上仅供参考，希望有所帮助

• wsll (2012-2-02 13:02:36)

  回答：
  1、刮去牙周膜组织要使用锐利的手术尖刀片刮取，把刀片加到刀柄上，便于施力；
  2、刮的时候，用力，使劲刮，刮下来的组织很少，能出来的细胞也很少，所以接种到T25细胞培养瓶内，或者是6厘米培养皿内；
  3、试试看组织块法，个人感觉不错，你的那个胶原酶没有用过；
  4、原代培养后48小时观察一次，确定没有污染后，可以一周后换液再观察，不要频繁观察，来回晃动，环境剧烈变化都不利于细胞贴壁变形爬出；
  5、一周换液时考虑因为细胞数量少，左旋谷氨酰胺代谢1周差不多了，所以1周后可以考虑来个半量换液，我培养过人的，大概需要10天左右才有细胞爬出，要有耐心。
  
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  谢谢您的解答！
  但是我把组织刮下来后，感觉就像棉絮状似的，没有成块的组织块！

• wsll (2012-2-02 13:03:02)

  没做过你那个，但是我们经常做原代皮肤成纤维细胞的培养，说说自己的看法
  1、 一般牙周膜的宽度在0.15-0.38mm左右，拔下的牙根上附着的就更少了，像这样的组织量较少是否有影响，怎样解决？？
  宽度在0.15-0.38mm左右应该是可以了，但是尽量多取组织，因为消化后细胞量过少，也是难以培养的
  2.胶原酶按0.2g/100ml配置，溶剂为pbs，可以吗？？
  我们一般直接用0.25%+EDTA+37度消化45-60分钟即可，牙周膜比较薄，应该很好消化。胶原酶作用比较弱，而且你配的浓度个人认为也比较低，怕是达不到消化组织的目的
  3.上述方法是否有不妥，或者有什么细节没有注意？？
  离心后应该去上清，加培养基重悬后吸出，再接种培养瓶
  4.还有别的吗？？
  组织消化培养应该还涉及细胞分离、培养和纯化的问题，没养过你那个，所以不知道你的细胞纯化怎么确立；另外，组织块培养法也是可以的，但是周期长，且容且污染。
  以上仅供参考，希望有所帮助
  
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  谢谢您的解答！
  1.您在刮取牙周膜的时候，用pbs湿润牙根面吗？
  2.EDTA不是螯合Ca2+、Mg2+的吗？不是一般都和胰蛋白酶混用吗？
  3.您说的离心后去上清，是说消化后直接离心，然后去上清，再加入培养液重悬，再离心吗？呵呵！
  4.您说的纯化问题，就是通过传代。然后免疫组化确定组织来源.

• sunnyB (2012-2-02 13:03:35)

  
  EDTA和胰蛋白酶混用有加强消化的作用，缩短消化时间；
  加入培养液重悬后不用再离心，直接接种培养瓶；
  纯化是指细胞的纯度，尽量去除杂细胞。可以用组化和流式的方法鉴定

• DNA (2012-2-02 13:04:07)

  谢谢您的解答！
  但是我把组织刮下来后，感觉就像棉絮状似的，没有成块的组织块！
  
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  哈哈，恭喜你，答对了，棉絮状的一坨，就是组织块，不是像某些文献上写的那样，什么还可以修剪成多大多大的，然后怎么怎么滴。
  你把那些絮状物，吹打混匀，然后接种，然后等着收获细胞吧。

• wsll (2012-2-02 13:08:44)

  哈哈，恭喜你，答对了，棉絮状的一坨，就是组织块，不是像某些文献上写的那样，什么还可以修剪成多大多大的，然后怎么怎么滴。
  你把那些絮状物，吹打混匀，然后接种，然后等着收获细胞吧。
  
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  谢谢您的解答，请问你们当时养的时候用的是什么培养液啊？我用的DMEM，但是看有的用了DMEM+F12的？

• 131415 (2012-2-02 13:09:16)

  谢谢您的解答，请问你们当时养的时候用的是什么培养液啊？我用的DMEM，但是看有的用了DMEM+F12的？
  
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  用的低糖DMEM！

• zzzz (2012-2-02 13:12:14)

  
  接种组织块的话，是不是将组织块接种到培养瓶一段时间后再加培养基呢？组织块会不会因为培养基的加入，位置不能固定，也就没有细胞贴壁呢？

• wsll (2012-2-02 13:12:44)

  接种组织块的话，是不是将组织块接种到培养瓶一段时间后再加培养基呢？组织块会不会因为培养基的加入，位置不能固定，也就没有细胞贴壁呢？
  
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  通常可以采用倒置培养的方法，接种组织块后，翻瓶添加培养液（即底朝上），并保持这样的方式在培养2-4h后，再把瓶翻过来。 供参考

• any333 (2012-2-02 13:14:05)

  通常可以采用倒置培养的方法，接种组织块后，翻瓶添加培养液（即底朝上），并保持这样的方式在培养2-4h后，再把瓶翻过来。 供参考
  
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  我倒没有那么复杂，直接5毫升体系，将组织块接种到培养瓶里面，或者是培养皿里面，48小时你观察一下，在镜下你能看到组织块其实是贴壁的，楼主也可以试试看，那种翻转瓶我开始打算试试看，结果发现很容易把组织块冲起来，而且也担心上面的组织块干枯了。
  不管怎么样，方法简便，实用的就是好方法。

• glass (2012-2-02 13:14:31)

  我倒没有那么复杂，直接5毫升体系，将组织块接种到培养瓶里面，或者是培养皿里面，48小时你观察一下，在镜下你能看到组织块其实是贴壁的，楼主也可以试试看，那种翻转瓶我开始打算试试看，结果发现很容易把组织块冲起来，而且也担心上面的组织块干枯了。
  不管怎么样，方法简便，实用的就是好方法。
  
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  您说的是，将组织块接种好了，直接加入一定量的培养液，然后就放在培养箱里孵育，是吗？

• qumm1985 (2012-2-02 13:16:42)

  您说的是，将组织块接种好了，直接加入一定量的培养液，然后就放在培养箱里孵育，是吗？
  
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  配置好生长液，把组织块用生长液吹打混匀，直接接种到培养瓶或者是6厘米培养皿里就行了，48小时取出观察一下确定没有污染后，放入培养箱，不观察了就，到第7天半量换液一下，顺便观察一下，我观察到的，一般10--14天就会有细胞爬出来。

• ALALA (2012-2-02 13:17:39)

  配置好生长液，把组织块用生长液吹打混匀，直接接种到培养瓶或者是6厘米培养皿里就行了，48小时取出观察一下确定没有污染后，放入培养箱，不观察了就，到第7天半量换液一下，顺便观察一下，我观察到的，一般10--14天就会有细胞爬出来。
  
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  您是用的CO2培养箱吗？
  我没欧诺个培养皿，用的培养瓶，到7天才开始换液的话，那谷氨酰胺不稳定，不是都已经降解了么？我们一般是接种1d之内不动，以免影响贴壁，之后每天观察，3d换液一次。之前都是用酶解，最近打算用组织块，可是发现组织块一直是在培养基里面漂来漂去的，不贴壁，无从生长。

• ALALA (2012-2-02 13:18:23)

  通常可以采用倒置培养的方法，接种组织块后，翻瓶添加培养液（即底朝上），并保持这样的方式在培养2-4h后，再把瓶翻过来。 供参考
  
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  是说，先接种组织，然后培养瓶翻过来，底朝上？这样，组织块不会因重力掉下来到培养基里面吗？

• woshituzhu (2012-2-02 13:18:56)

  您是用的CO2培养箱吗？
  我没欧诺个培养皿，用的培养瓶，到7天才开始换液的话，那谷氨酰胺不稳定，不是都已经降解了么？我们一般是接种1d之内不动，以免影响贴壁，之后每天观察，3d换液一次。之前都是用酶解，最近打算用组织块，可是发现组织块一直是在培养基里面漂来漂去的，不贴壁，无从生长。
  
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  左旋谷氨酰胺代谢需要1一周的时间，一周之内没有细胞爬出来，所以3天换液是没有必要的，组织块你接种了，肉眼看是漂浮的，镜下看看，是贴壁的。
  还有，人牙周膜细胞从组织块种爬出没有你想象的那么慢，我的师妹上周一做的原代培养，用的就是我一直用的方法，今天实在耐不住观察了一下，发现已经有个别细胞变形爬出了。
  我用的是二氧化碳培养箱，你放心，如果不可行的方法，我是不会来这里胡扯八道的，而且假如你标本够的话，不妨试一下，实践是检验真理的唯一标准。

• ALALA (2012-2-02 13:20:53)

  左旋谷氨酰胺代谢需要1一周的时间，一周之内没有细胞爬出来，所以3天换液是没有必要的，组织块你接种了，肉眼看是漂浮的，镜下看看，是贴壁的。
  还有，人牙周膜细胞从组织块种爬出没有你想象的那么慢，我的师妹上周一做的原代培养，用的就是我一直用的方法，今天实在耐不住观察了一下，发现已经有个别细胞变形爬出了。
  我用的是二氧化碳培养箱，你放心，如果不可行的方法，我是不会来这里胡扯八道的，而且假如你标本够的话，不妨试一下，实践是检验真理的唯一标准。
  
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  谢谢谢谢，是这样的，我是做动物细胞的，不过我认为，虽然培养的细胞种类不同，但理论基础应该是一样的，也丝毫没有认为您是乱说的想法，仅表达下疑问，更好的学习。之前都是酶解，组织块没做几次，下次实验实践下。

• sunnyB (2012-2-02 13:22:06)

  是说，先接种组织，然后培养瓶翻过来，底朝上？这样，组织块不会因重力掉下来到培养基里面吗？
  
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  不会的，这样做就是帮助组织块贴壁，也有采取将培养瓶立起来的方法，目的是减少组织块周围的水分。
  还有楼上的方法应该也行。 貌似有人称之为 自然贴壁法。

• sunnyB (2012-2-02 13:22:28)

  左旋谷氨酰胺代谢需要1一周的时间，一周之内没有细胞爬出来，所以3天换液是没有必要的，组织块你接种了，肉眼看是漂浮的，镜下看看，是贴壁的。
  还有，人牙周膜细胞从组织块种爬出没有你想象的那么慢，我的师妹上周一做的原代培养，用的就是我一直用的方法，今天实在耐不住观察了一下，发现已经有个别细胞变形爬出了。
  我用的是二氧化碳培养箱，你放心，如果不可行的方法，我是不会来这里胡扯八道的，而且假如你标本够的话，不妨试一下，实践是检验真理的唯一标准。
  
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  楼上你接种的时候，会剪切组织块吗？一般剪成什么样，什么标准？ 还有就是你的这种方法需要同培养箱的同学不要总是不小心碰到你的培养瓶奥！

• 66小飞侠 (2012-2-02 13:23:48)

  是这样的，我是做动物细胞的，不过我认为，虽然培养的细胞种类不同，但理论基础应该是一样的，也丝毫没有认为您是乱说的想法，仅表达下疑问，更好的学习。之前都是酶解，组织块没做几次，下次实验实践下。
  
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  哈哈，没有了，我没有生气的意思，我说话是这个风格，比较直接。人的细胞生长的慢，刚才说错了，是没你想象的那么快。
  人的细胞很慢的，我做的小型猪牙周膜干细胞，7天-10天都可以贴壁变形爬出来，就是人的每次必须拖够10天以后才出来。