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[分享帖]细胞冻存与复苏

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2012-2-07 16:29    作者: abc816    来源: 分析测试百科网

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[分享帖]细胞冻存与复苏


细胞的冻存是保持细胞系的重要途径，因此掌握细胞冻存技术对实验研究者来说是不可缺少的，现介绍自己成功冻存的经验，与大家共享
1 冻存细胞健康程度 一般要求活细胞在95%以上，细胞活力差的在冻存后的成活机率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存
2 冻存细胞量要多，一般10*6-7/ml，冻存液比例培养基7：血清2：DMSO1，也有将血清比例加大的做法，有的甚至将血清提高到90%，具体浓度视经验而定
3 混合DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合之后应尽快冻存
4 冻存 遵循缓冻速融原则，冻存步骤为-4度30分钟—— -20度1-2小时—— -80度过夜——沉入液氮。也可以用棉花或泡沫塑料封好后直接-80过夜，然后沉入液氮
5 复苏 将冻存细胞取出，快速放入37度水浴中待细胞融化后立即取出，超净台上转至细胞瓶中，然后缓慢加入培养基，边加边摇动细胞瓶，最后加20%血清
6 后处理 复苏后1-2小时，待细胞贴壁后，缓慢将培养液倒出，加入新鲜培养基，血清（15%），培养3天观察
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  • idea2011 (2012-2-07 16:30:11)


    补充：
    悬浮细胞冻存时，DMSO的浓度为5％。血清浓度为10％

  • one (2012-2-07 16:30:44)

    QUOTE:

    原帖由 idea2011 于 2012-2-7 16:30 发表

    补充：
    悬浮细胞冻存时，DMSO的浓度为5％。血清浓度为10％
    能不能说明一下什么理由悬浮细胞就可以用5%的DMSO冻存，因为根据个人有限的资料好像还没有看到哪一本书或教材里提到可以用5%DMSO冻存悬浮细胞。
    希望这个5%DMSO的细胞冻存液不会对新手起误导作用， 所以必须讲清楚原理。

  • wmp1234 (2012-2-07 16:31:02)


    现在我们这里许多人先直接－20度2小时，然后－70度，复苏后细胞也还可以，不过没有放在液氮里边好，供参考，各位认为有何不妥

  • hot_hot_hot (2012-2-07 16:31:22)

    细胞冻存还是缓慢冻存好一些，-4度1小时， -20度4小时 ，-80度过夜，次日放入液氮中。一些简化的步骤有时也是可行的，但我感觉还是循规蹈矩点好，特别是有一些细胞比较娇气，经简化步骤冻存的细胞复苏后活性差的很！

  • 小野花 (2012-2-07 16:31:48)


    我想请问一下，前日由于我的粗心，冻存的细胞放在4度十多个小时才记起,再放如-20和-70.不知这样的细胞,复苏好吗？

  • HP007 (2012-2-07 16:32:16)

    冻存的技巧在于细胞的生长状态和冻存液的配制，DMSO的主要作用是防止冰晶的形成，因此如果在4度放置过久，冻存的效果不会好！提醒各位注意的是加入冻存液后一定要混匀，防止DMSO沉淀。

  • caihong (2012-2-07 16:32:54)

    细胞在4度存放的时间过长，细胞的活性将受到很大的影响，复苏后死细胞特别多，即使有活细胞其活性也很差。你的细胞在4度已放了十多个小时了，建议废弃，以后注意就行了。

  • jujuba (2012-2-07 16:33:34)


    我冻存细胞时为保持细胞均一性，想一次多冻些细胞，请问用谁用过nunclon 的Triple flask，消化吹打是否容易控制，会不会消化过。谁还有别的方法能一次多冻些细胞？谢谢！

  • redbutterfly (2012-2-07 16:34:03)


    消化后直接用10%DMSO+90%血清冻存即可.....

  • 8964357 (2012-2-07 16:34:20)


    请教：本实验室没有液氮，担有-70度的冰箱，请问冻存步骤一样吗？

  • lixi559 (2012-2-07 16:34:38)

    是呀，不明白为什么悬浮细胞冻存时，DMSO的浓度为5％。能解释一下吗？

  • zsxan1990 (2012-2-07 16:35:16)

    请教一个问题。
    我的悬浮细胞复苏后加入培养基后非常浑浊,并有云絮状悬浮物。
    请问这是正常现象吗？
    我当初冻存时没有注意调整细胞浓度，反正好多细胞都冻到一个管里了。

  • ffooll (2012-2-07 16:35:51)

    虽然原则是慢冻快融,但冻存不能太慢,4℃一个小时足够,－20℃最好不要超过4个小时,细胞在－20℃到－30℃是个危险区域,容易死亡。有人喜欢复苏后离心去除DMSO，我觉得不好，刚复苏是细胞脆性大，很容易离碎细胞，等贴壁后在去最好。

  • xueyouzhang (2012-2-07 16:36:11)


    楼上的，我曾经试过，同一管细胞，同时用离心去冻存液和直接保留冻存液培养，发现有冻存液的状态很不好耶！

  • 一叶 (2012-2-07 16:36:41)

    虽然原则是慢冻快融,但冻存不能太慢,4℃一个小时足够,－20℃最好不要超过4个小时,细胞在－20℃到－30℃是个危险区域,容易死亡。有人喜欢复苏后离心去除DMSO，我觉得不好，刚复苏是细胞脆性大，很容易离碎细胞，等贴壁后在去最好。

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    DMSO4度以下对细胞毒性小，但4度以上对细胞毒性则显著增强，所以还是建议复苏后离心袪除冻存液，离心转速可以控制1000左右。复苏在于快，我一般是将其放入50度左右水浴中（37度水浴中冻存管内肯定不到37度），摇动不到1分钟，一成液状时就拿出水浴，（此时冻存管内温度还较低，避免DMSO对细胞毒性），这样复苏细胞活力与冻存前近似。

  • gemei0115 (2012-2-07 16:37:07)

    虽然原则是慢冻快融,但冻存不能太慢,4℃一个小时足够,－20℃最好不要超过4个小时,细胞在－20℃到－30℃是个危险区域,容易死亡。有人喜欢复苏后离心去除DMSO，我觉得不好，刚复苏是细胞脆性大，很容易离碎细胞，等贴壁后在去最好。
    DMSO不是对细胞也有毒性吗？不去除直接培养可以吗？
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