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[讨论帖]细胞培养细节注意事项
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我看的资料结合自己的体会整理的，希望对大家有益，我随时把想到看到的加进去，希望大家跟帖给点评论或说说你的体会
1.操作前打开紫外灯30-60分钟，这个大家都知道。不过你别忘了还要在操作前至少10分钟打开抽滤装置来保证效果，但紫外消毒期间建议不要进去一次特意打开抽滤装置，可以与紫外灯一起打开，此时不需要抽滤开的过大就可以。（所谓的抽滤装置就是就是那个风机，就是吹风超净工作台，不是过滤培养液的）
2.关键一点，更换培养液或弃去消化的酶时，一定要吸除。我发现许多人都是直接倾倒这样虽然很省事，但是容易引起瓶内废液雾化造成污染。还有严格的要求是废液应该用负压抽滤走的，但这一点很多实验室满足不了，有的人干脆就用烧杯来盛废液，这很不好，原因还是易引起废液雾化。如果实在条件限制，你可以选用瓶口稍小一些而瓶身高的容器，一定要用吸管吸出废液或酶，不要再倾倒了呀
3.培养箱里下面的盛水的托盘一定不要等水要没了才换呀，那是用来维持培养箱湿度的，即使不缺水也要至少1周更换一次，要用高压过的双蒸水。有人为了抑制托盘里长细菌加抗生素这当然可以，其实可以把托盘里的水调成饱和的磷酸氢二钠溶液就完全可以抑制细菌生长了。（磷酸氢二钠加到饱和就是刚好要析出时再加点液体）
4.吸过营养液或血清等液体的吸管就不要再用酒精灯烧了，再烧就会形成一层碳化膜，对细胞有影响的呀（只需要刚取出时过火并注意不要碰到其他无关区域）
5.吸过一种液体的吸管不能再吸另一种液体以免交叉污染，这我不说你也应该知道。我要说的的是，你刚加过一次液的吸管可能因取别的物件把吸管含在手上或指间时注意角度方向以免管内残液倒流，如果残液已经倒流到塞棉花那里，那请你马上换新管，不要用它继续加样了。
6.工作台内只限放每日工作所必需的物品其他非必需物应去除或放别处。因为堆积过多影响紫外线消毒效果，并且所放的必需的物品也绝对不能遮挡台面上的抽滤排气孔道。
7.盛装培养液酶等的瓶子绝对不能装的过满，主要因为盛装后如放冷冻中会膨胀导致涨开瓶塞或容器（这与冷冻管不能装的太满一个道理），另外装的太满你用的时候打开后放到斜面上会液体过于接近瓶口或溢出。
8.你的培养液应保存在4度或-20度，并且一定注意：要保存在暗处。因为培养液中有几种成分为光敏的。就是说你的冰箱不能是那种透明的（从外面看就能看到里面有什么的那种），如果是透明的，那就要遮挡冰箱成暗的或把培养液的瓶子用棉花包裹。
9.培养液配好后应在无抗生素下进行无菌培养。在过滤培养液的开始及结束留取样本。置37毒5%二氧化碳培养箱72小时（至少24小时）确定无污染方可使用。具体可用高压过的离心管留取样本培养，最好同一培养液盛两管一个盖子松些后者盖紧可对照看（也可排除二氧化碳对营养液颜色的影响）
10.培养液应该加的量，一般占培养瓶容积的10%为适，维持液面高度2-5mm，其中的接种密度为10的5次方左右。所以你不必怕细胞缺营养，加过多的液体（当然悬浮细胞稍多点没什么）。最要注意的是，贴壁细胞传代后培养液绝对不能过多，否则贴壁时间将明显延长。
11.关于酶消化的问题。你不能完全依靠时间来决定消化程度，因为同一细胞不同的处理（如加药的和不加药的）甚至不同的传代数对酶的耐受不尽相同。所以，最好要在显微镜下看消化程度（有经验了直接肉眼看瓶底面也可知大概）并确定终止消化的时间。注意，如果万一消化过了，就是看到瓶上的细胞没吹就下来了融到所加的酶里了，那请你马上向瓶里加培养液（宜稍多）终止消化（血清有终止作用，同时酶得到了稀释），然后离心，去上清，制单细胞悬液，再根据细胞情况传代或原瓶见液（细胞过少就不1分为2）。还要说的问题是，加酶消化时不要把酶直接加到细胞面上要等加好后，倾斜酶液浸入细胞内，量刚好覆盖即可。单次消化很多细胞时（比如5瓶），可一瓶一瓶处理，但慢些，还浪费时间和吸管等。当然可以先依次把各瓶加入酶然后统一放显微镜下看，但一定注意，要细胞面在上，加酶在底面，都加完后，拿到显微镜处，不要全翻转过来消化，那样容易看不过来，出现消化过大情况。可一瓶一瓶翻转或仅先翻转几瓶，消化好的再翻转瓶放置使酶停止接触细胞面。
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最新回复
loli (2012-2-08 15:47:54)
谢谢，非常有用，但是有几个问题想请教：
1.想问您抽滤装置是什么，是用来吹风超净工作台的吗？
2.如果把托盘里的水调成饱和的磷酸氢二钠溶液，我一般一次加500ml消毒过的双蒸水，要加磷酸氢二钠量约多少？
吴才子 (2012-2-08 15:48:36)
楼主所说的抽滤装置是不是指的用来过滤培养液的呀？我已经预定了CORNING的灭菌包装滤器，请问可以直接使用么？
greenbee (2012-2-08 15:48:59)
铜雀 (2012-2-08 15:49:30)
QUOTE:
L－Glutamine （ 2mmol/L ）用量是300mg/LHeps 用量是1g/L
是用三蒸水加到1000ml
BUK (2012-2-08 15:49:55)
在购买的粉状/液体培养基中会有说明,是否已含有L－Glutamine.如已有,在普通细胞的培养中可以不用再添加;当培养液在4度超过一周,才补充!
在配培养液时,在1000毫升种添加Hepes 2.38 g/L.
shenkunjie (2012-2-08 15:50:19)
废液应该用负压抽滤走的：此装置非常想手术室的吸引器，抽废液时将管子安上吸管脚踩踏板自动就吸走了，感觉实在爽，还痛快
了了 (2012-2-08 15:51:00)
我在培养细胞时，发现有时候细胞会突然的脱落
培养液里面好象有许多模糊的小东西，但细胞形态起初是不明显改变的
能否指点一二？
铜雀 (2012-2-08 15:51:32)
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