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[分享帖]贴壁细胞消化方法总结
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分享下我的贴壁细胞消化 方法资料，希望能帮助到大家~
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一、酶消化法。
1、胰酶。这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。
2、胶原酶。这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下细胞。这种方法作用温和，对细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。
二、离子螯合剂：不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。
1、EDTA。用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度。它不能被终和。因此，消化下来的细胞要洗一遍。
2、商品化的无酶消化液。个人的使用经常觉得对细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。
三、物理法。直接吹打或用细胞刮子将细胞刮下来。
四、冷冻法。此方法仅能用于细胞传代时。无法使组织上的细胞脱落下来。本方法的原理，我想是因细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。优点是：对细胞损伤小，不需要中止或洗细胞，方便，不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的细胞。不足是细胞常成小片脱落。此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。具体过程是：1、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5ml/孔)，2、再加0.5ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落，3、轻轻吹打，细胞即完全脱落，4、按一定比例传代。
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最新回复
中国特色 (2012-2-22 13:28:10)
1，先用PBS把细胞洗两遍，使瓶内没有血清了，减少对胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在细胞有些消化下来时，拿着瓶口，运用手腕的力量轻轻震荡瓶内液体，这样细胞很快就下来了，还不需要吹打，分散也均匀
2，成团、絮状：
消化液里加入edta可以减少细胞成团的现象，血清可以终止胰酶的作用，如果是进口血清的话也能终止edta的作用。用胰酶消化后胰酶可以倒掉，也可以不倒，直接加血清终止，如果消化液中加入了edta的话，就要将消化液倒干净，如果细胞贴壁要求不是很严格的话，一般不需要进行离心。
鼻咽癌细胞。这种细胞的贴壁能力很强，用0.5%胰酶（含0.1%EDTA）一般要消化12~15min。用PBS洗涤时要洗净残余的培养基，加入胰酶后在培养箱中消化（避免细胞室温下受损以及在此温度时胰酶活性最强）至细胞收缩变圆（可显微镜下观察）且有少许细胞脱落（有流下来的趋势），随后立即弃去胰酶（如果脱落的细胞很多且需要大量细胞实验，则不能弃去胰酶），加入培养基仔细吹打（不能用无血清培养基或者PBS替代，否则细胞聚集成团块或絮状）。一般我都离心一次弃去上清（去除残留的胰酶及漂浮的死细胞或细胞碎片）。
中国特色 (2012-2-22 13:28:42)
马上用培养基中和，用吸管吹打细胞，收集全部的细胞到以无菌的离心管中800RPM 3分钟。弃上清，用全培重悬，换新的培养瓶继续培养！！状态不好的细胞在培养的过程中会死亡脱落，在换液的时候可以清除掉！！
中国特色 (2012-2-22 13:29:00)
一、加入胰酶等细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；二、加入胰酶后，镜下观察待细胞始脱落时，弃胰酶，加培养液分瓶。但前者太麻烦，而后者有可能对细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的细胞先脱落，对肿瘤细胞来说，这部分细胞有可能是恶性程度较高的细胞亚群。
一种简单的消化传代方法。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用（30s），弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将细胞消化单细胞。
对于较难消化的细胞，可以用2%利多卡因消化5-8分钟，然后再弃去，加培养基吹打也可以，对细胞的影响不大。
不用PBS也不用Hanks洗，只要把旧培养液吸的干净一点，直接加酶消化应该不会有什么问题。
弃培养液后，用0.04%的EDTA冲洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室温孵育5min，弃取大部分EDTA，加入与剩余EDTA等量的胰酶（预热）总体积1/10v。消化到有细胞脱落。不过有人说EDTA对细胞不好，有证据吗？
培养的BASMC：倒掉旧培养液加入少量胰酶冲一下，倒掉再加入0.125-0.25%胰酶约6-10滴或1ml（25ml bottle）消化再加入适量新培养基中和，并分瓶这种方法简单、省事；效果很好并且不损失细胞！
04906 (2012-2-22 13:29:32)
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有些癌细胞贴壁能力非常强，比如我现在在传代的是膀胱癌移行细胞，胰酶消化后加入培养基就会马上贴壁，根本吹不开。我师姐传了一个月左右的师姐，摸透了它的脾性，原本使用培养基消化，改为使用D-hanks消化，消化和传代的效果都比较好。
新的细胞的培养，还真的是比较磨人的，单单一个消化时间的把握，就要摸索很长时间呢。
kewanqi2011 (2012-2-22 13:29:55)
胶原酶是不能用血清终止的。
中国特色 (2012-2-22 13:30:25)
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可以的啊，跟胰酶一样。
中国特色 (2012-2-22 13:30:43)
新的细胞的培养，还真的是比较磨人的，单单一个消化时间的把握，就要摸索很长时间呢。
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嗯，很高兴能分享您的经验。原本使用培养基消化，改为使用D-hanks消化？培养基不是终止消化嘛？单独使用D-hanks消化 ？
join (2012-2-22 13:31:13)
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嗯，单用D-hanks终止消化，不然根本吹不开，培养基一加进去就贴成团了。
66+77 (2012-2-22 13:31:38)
细胞消化难题：成团、絮状：现在买的胰酶也是含有EDTA的，细胞还是容易成团，
一种简单的消化传代方法。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用（30s），弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将细胞消化单细胞。这种方法是简单，可是时间不好掌握，前一秒还好好的，下一秒细胞都脱落了，不知道损伤是不是更大。
kswl870 (2012-2-22 13:32:10)
一种简单的消化传代方法。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用（30s），弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将细胞消化单细胞。这种方法是简单，可是时间不好掌握，前一秒还好好的，下一秒细胞都脱落了，不知道损伤是不是更大。
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消化细胞进行传代的时候，不就是要把细胞消化道脱落吗？
终止消化的标志是什么？难道只是细胞稍微萎缩？还没有脱落，就终止胰酶消化，然后用培养液吹打？
我每次都是消化到细胞全部掉哦，不过时间久点，让我好不爽的。如果只是要求细胞不脱落就可以了，那我花的时间应该还少点。
中国特色 (2012-2-22 13:32:44)
终止消化的标志是什么？难道只是细胞稍微萎缩？还没有脱落，就终止胰酶消化，然后用培养液吹打？
我每次都是消化到细胞全部掉哦，不过时间久点，让我好不爽的。如果只是要求细胞不脱落就可以了，那我花的时间应该还少点。
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一般消化到绝大部分脱落，如果紧接着做流式的话，切不可消化过度。
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