[求助]用过transwell或养过Caco-2细胞的请进

最新回复

• vivian4123 (2012-3-06 15:48:41)

  
  目前我也在做这个试验，对你的问题进行讨论，共同学习。
  问题一的解决：提高细胞密度，5次方以上，用移液枪均匀滴加植入millicell中即可。
  问题二三：Caco-2细胞生长一定密度和时间，细胞间形成紧密连接以及细胞表面分化出微绒毛，换液不小心会导致块状脱落或被吸出，可以在每次换液时，只换部分培养液解决。对于你提到白色漂浮物，我想这可能是细胞分泌或分化过程有关。
  另外，我观察了24孔培养板中培养1～30天的Caco-2，1～3天细胞间无边界、块状生长，4天后，视接种细胞密度情况，基本可以形成紧密连接。
  备注：如在南京，可以面谈。细胞生长照片等整理好可以上传。

• langlang (2012-3-06 15:49:09)

  
  呵呵，我在北京，离你太远了。问一下，你是用密里博的插入式小室，即millicell么？我怀疑他们的膜不利于细胞贴壁。我的细胞接种到膜上已经一周了，但在倒置显微镜下，我只能看到中间有零星的细胞，观察不到成片的形态（不象培养瓶中形态）。如果说细胞密度少（3*105也不少了），但每隔一天换液时，培养液明显变黄，而且我还测电阻了，电阻值一直在增加，这是怎么回事呢？难道我一直没找到细胞？每次移动培养板时，可以看到有很多细胞在动，似乎细胞没有贴壁，如果是死细胞换液后就应该没有了，但换液后这些东西还在，难道是分化的微绒毛？真痛苦啊！你有没有长在膜上的Caco-2细胞形态啊！如能指点一二，万分感谢！

• viviwang1987 (2012-3-06 15:49:31)

  膜上的细胞是观察不到的

• langlang (2012-3-06 15:49:49)

  
  啊，是么?在倒置显微镜下观察不到细胞单层么？但是有的文献说21天后可以观察到膜上细胞的形态，怎么回事呢？是不是我养的时间短所以观察不到细胞啊！问另外一个问题，你测电阻么？我的细胞在接种后的第8天电阻为（241-143）*4.2=411.6，计算公式：（有细胞电阻值-无细胞空白电阻值）*六孔板膜面积，文献上说电阻大于250表明细胞即可使用，那岂不是我现在就可以开始吸收试验了？但不是21天才能形成单层么？能帮我解释以下么？谢谢！

• yychen (2012-3-06 15:50:07)

  
  在倒置显微镜下是不是能观察到细胞，要看你使用的transwell是什么材料的，如果买的是聚碳酯的只能染色后观察，如果买的是透明聚酯膜就可以直接观察了
  纹鹿你在北京哪个单位，我也正在做Caco－2相关试验，可以交流一下吗？

• chuntian1983 (2012-3-06 15:54:27)

  
  我也正在做这个实验，我在往膜上种细胞后，与你的现象正相反，中间有一个缺口，边上的细胞到练成一片。不知道是不是细胞种的不匀。还是没有长融合，或者是被细菌破坏了，在显微镜下是看不到细胞的，所以各种因素都不能确定，我种的密度是5次方，也不行，很郁闷。我在天津

• qumm1985 (2012-3-06 15:54:51)

  我做过的，不过也不是什么高手，应该是要测膜电位来确定是否单层完全融合吧，换液的时候一定要轻，不能够碰到下面的，说时候transwell也实在说太贵了，一个那么小的孔就是30快钱，还是一次性的。

• any333 (2012-3-06 15:56:35)

  大家好！
  高兴看到这个帖子。请问：药物也要做倍比稀释吗？
  有没有统一的阳性对照？结果怎么分析呢?
  
  还有，我现在培养瓶里的细胞3天就可以基本长满，
  为什么millicell要21天呢？
  非常感谢，！！

• 8964357 (2012-3-06 15:57:03)

  我也正在养CACO-2 细胞，培养了快18天，细胞在TRANSWELL 上漂着一层膜，我不确认除了这膜紧贴着TRANSELL上是否也又一层膜

• u234 (2012-3-06 15:58:32)

  看到这个标题时真是激动了一会，因为我也要开始养Caco-2细胞了，请大家指教啊。买那millicell是不是就是他们说的插入式培养皿啊？造这个模型是要什么样的装置？是millicell好还是transwell好？

• zsxan1990 (2012-3-06 15:59:29)

  我这有一包millipore的millicell插入式培养皿，买了有两个月，但是现在做实验发现和我们的染毒装置不配套，所以现在想转卖掉，型号PICM03050,可以和六孔板配套，只是和我们另外一套染毒装置不配，想要的同志可以联系我啊，价格绝对优惠。谢谢！

• gogo (2012-3-06 16:00:35)

  大家好！
  我也正在用millicell养caco-2细胞，我用0.4um的多聚碳脂膜，所以接种细胞后在显微镜下是看不到细胞的，只能看到密布的小孔。
  但是等到十几天后，细胞开始分化（我观察认为是分化了）时，可以在镜下看到一些聚集的小亮泡，轻摇六孔板，它们还会随之摆动，但是无论换液还是pbs冲洗都是不会被冲洗下来的，随着越接近20d，它们会越多，所以我觉得这些可能就是分化后的微绒毛吧。
  还有，楼主所说，8d电阻值已经到达>200的要求，这只是评价此模型完整性的一项指标吧，电阻值符合要求但是如果未到21d以上，模型没有分化完成，也是不能进行下步试验的。
  以上只是我试验中无数碰壁后的一些经验，希望大家多交流~~

• BUK (2012-3-06 16:00:56)

  
  我用的是0.4um的多聚碳脂膜，养的是bend。3细胞（小鼠脑微血管内皮细胞），不知道怎么回事，今天是种进细胞的第四天，细胞的电阻没有明显变化，我接种的密度是2.5×10的5次方，难道是细胞没有贴壁？同瓶细胞种24孔板，第2天就基本长满了。因为膜是半透明，看不到细胞的情况。我的transwell里面的培基一直都满红的。

• zhenxin (2012-3-06 16:01:23)

  
  大家好！我最近也要开始养Cao-2细胞了，正在准备transwell培养板，不知道大家都是在哪个公司买的，价格如何？最小包装是多少？急需得到大家的帮助，也希望能多学习！谢谢！

• zhenxin (2012-3-06 16:02:00)

  
  请问小室都要铺胶吗？从哪买胶啊？听说胶的保质期很短，只有3个月，还有具体怎么操作啊？好多问题不懂，谢谢！

• zhenxin (2012-3-06 16:03:15)

  我刚定了Corning公司的，通过华粤行仪器公司，说是40-50天到，货号3401，12孔板，聚碳酸酯膜，膜孔径0.4um。有需要买胶的同志吗？可否合买？我在郑州，谢谢！

• dongdongqiang (2012-3-06 16:03:41)

  
  看到这个帖子太激动了，遇到这么多有经验的同行，多多指教啊，我养这个细胞半年多了，一直是在25平方厘米的培养瓶里面养，但是非常糟糕，刚开始长的很好，1：3传代都差不多第三天就长满了，可是传过几代后就越来越不好了，贴壁活的越来越少，而且瓶子中间部分扎堆，边缘却越来越少，并且生长缓慢，而中间越挤越密会出现很多空泡，慢慢就都死掉了。并且培养期间培养液很脏，很多黑色物质，但是培养基颜色没有变黄也不浑浊。请问有人知道这是怎么回事吗？
  PS：纹路和serchina分别是北京和南京什么单位啊？还在养这个细胞吗？我是石家庄，可以好好交流下吗？

• shenkunjie (2012-3-06 16:04:13)

  
  跟HT29的情况差不多

• wsll (2012-3-06 16:05:25)

  原因可能是细胞消化不彻底，只消化到了块状的细胞团，就简单吹散就传代了，块状的细胞团换液时就丢失了，这种情况下细胞越传代数量就越少。这个细胞在局部融合后就会形成紧密连接，光学显微镜下观察像网格样结构，很难消化分散。
  
  解决办法：
  （1）PBS洗1~2次后，37度的胰酶消化5~20min，镜下观察直到用手轻拍就有大量单个细胞脱落，
  （2）对于传代后的细胞，每次传代的细胞不要培养太长时间，<5~7d，按照这样两点基本可以解决培养问题了。
  
  另外培养过程中，有些细胞分泌物分泌到培养基中，镜下可以见到絮状颗粒，PBS冲洗2~3次就可以去除了。

• yapuyapu (2012-3-06 16:05:55)

  我的情况正好与你相反，用的是玻璃瓶，总是中间少，边缘多，周围好多同学也都出现了这种情况，不知道是什么原因？