[求助]肝星状细胞原代培养

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• 66+77 (2012-3-06 16:42:21)

  
  有可能是细胞黏附在一起了，建议在洗涤的过程中加入DNA酶，防止细胞黏集。另外，建议改进以下方法：
  1.第一步Hanks灌流的时间要延长至5~8 min，这样才能充分冲走血液；
  2.灌流和胶原酶消化步骤间，应加入链酶蛋白酶，消化肝实质细胞；
  3.胶原酶消化后，应用含DNA酶的DMEM洗涤2～3遍。

• 8princess8 (2012-3-06 16:42:38)

  
  原代细胞的分离要求很严格，否则会得不到细胞，或者即使得到细胞的状态也很难保证。
  1.D Hanks液灌流的时间可适当的延长，灌流速度也可以适当的加快，促进血液的排出。但建议灌流3－5分钟就应该游离肝脏了，因为游离要十分的小心，需要5－8分钟的时间，这样就可以边灌流边游离了。
  2.酶灌流液的配方应包括0.1％的胶原酶和0。05％的链酶蛋白酶E，10mMhepes及双抗。液体量也可以多一些以增加灌流效果。
  3. 组织消化液也需增加链酶蛋白酶E。
  4.消化后用200目的纱网过滤，可替代100g，10分钟的离心时间。
  5.350g的离心时间也可以降低5－8分钟，及加percoll后离心时间20分钟也行了，若不放心，可适当的提高速度至1000－1500g（因分离液不同，时间不同）
  总之，中间的操作时间尽量的减少，以保证细胞的活力。还有就是各种液体的配方需要调整。
  仅供参考

• 49888 (2012-3-06 16:43:55)

  
  弱弱地问：800g离心30min，是什么意思？刚刚学习细胞培养，见过“1000r/min离心10min”，可是理解不了“800g离心30min”。请帮忙解释一下，多谢了：）

• tuuu2 (2012-3-06 16:45:14)

  
  800g是离心力，1000r/min是转速，二者可以相互换算
  不同的转头由于离心半径不同，在相同转速下离心力不同

• pencil菲 (2012-3-06 16:46:38)

  由于肝星状细胞在肝内的数量比例很低，密度又和其他几种肝脏非实质细胞接近，因此较其他细胞的分离步骤而言，步骤比较多，操作时间较长，且细胞的纯度很难控制，国外采用的淘析离心纯化方法及其仪器目前在国内难以达到。