[求助]心肌成纤维细胞胰酶消化法

最新回复

• milkdog (2012-3-15 12:47:10)

  
  明显是消化过度了。心肌细胞培养最典型的特征就是多次消化和差速贴壁，应该注意的是酶的浓度和消化的时间，你刚开始做酶的浓度不宜过高，0.06%-0.1%就可以了，量也不宜太多，体积是心肌组织的1倍即可，太多了浪费，消化时间自己掌握，一般是每次消化10分钟，后吸出消化液，再加胰酶消化，后几次根据消化 的状态可适当减少消化时间。因为心肌细胞被消化为单细胞悬液，如果在胰酶中时间过长就会死亡，所以才要每次都吸出，再用含血清的培养液中和酶的作用。

• bananapeople (2012-3-15 12:47:48)

  
  同意二楼的意见,我也觉得是消化过了.
  组织块的消化是从外到内的过程,消化不充分顶多有细胞的浪费,却可以保证得到活细胞

• 彼岸花opp (2012-3-15 12:48:16)

  谢谢答复，我要的是心肌成纤维细胞，不是心肌细胞，今天我也采用分次消化，不过吸取消化液镜下观察似乎未见细胞，培养箱贴壁90分钟后只见零零星星几个圆形细胞，细胞数太少了，我之前也想是胰酶消化过度，但我用的胰酶是前辈留下的似乎很旧，是不是消化不足，同学建议加EDTA，或者用胶原酶。诸位建议呢？还有停止消化，含血清的培养基要加多少滴（量）？要不要把组织块过滤呢？因为同学说组织块留着旁边会长很多细胞。请帮忙解答下，谢谢！

• ha111 (2012-3-15 12:48:40)

  QUOTE:

  原帖由 彼岸花opp 于 2012-3-15 12:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  谢谢答复，我要的是心肌成纤维细胞，不是心肌细胞，今天我也采用分次消化，不过吸取消化液镜下观察似乎未见细胞，培养箱贴壁90分钟后只见零零星星几个圆形细胞，细胞数太少了，我之前也想是胰酶消化过度，但我用的胰酶是前辈留下的似 ...

  1 胰酶太旧，肯定不行．换新的吧．加点EDTA效果更好.
  2 胰酶消化力太强，换胶原酶好一些，但是太贵，消化时间要大大延长.
  3 中止胰酶最好加等量含血清培养基，最好离心一下，换新培养基重悬接种.
  4 组织块不必过滤，过滤会损失部分细胞；另外的好处如你同学所说.
  5 看来你的同学对细胞培养经验很多，多多请教吧.
  GOOD LUCK!!

• milkdog (2012-3-15 12:49:00)

  
  心肌细胞和心肌成纤维细胞都是原代培养，贴壁前的操作是一样的。
  有一种方法是可以组织块培养，细胞可以爬出来，但不适用于心肌细胞。
  你最好重新配胰酶，可以加适量胶原酶，消化为单细胞后再培养，因为你不用心肌细胞，可以不过筛网，直接贴壁，过90分钟后，换培养液就可以了。
  每次消化后的含细胞的消化液都要用等量的含血清的培养液中和，酶里可不加EDTA，因为不能被培养液中和，会影响贴壁。
  具体的酶浓度，消化时间最好自己摸一下，每个实验室的条件不相同，略有差异。

• leifengta (2012-3-15 12:49:23)

  
  建议不用胰酶，改用２胶原酶，虽然贵点，但效果很好　　

• skytree (2012-3-15 12:49:47)

  
  本人就是做心肌成纤维细胞原代培养,根据我的经验,使用0.1%的２胶原酶消化,37度水浴消化40分钟后,再差异贴壁,效果很好,成纤维细胞成活率很高,上面的朋友不妨借鉴使用.
  祝好运!

• vvmmoy (2012-3-15 12:50:13)

  前面用胰酶消化看到都是圆圆的细胞，用同学的GIBOCO的胰酶效果差不多，成纤维细胞贴壁后应该是慢慢变梭形的才对啊？不知道自己看的是什么细胞。还有请问2型胶原用来消化心肌哪个厂家好呢，100mg多少钱啊，Worthington 的100mg450元，其他公司有的才245元，也是进口的。我看文献用0.1％2型胶原酶＋0.1％胰酶这样效果会更好吗？

• pengke1983 (2012-3-15 12:50:52)

  
  我做CFs用的就是胰酶消化法，原代培养时用0.1%的胰酶，消化10min，取上清液，用等量含血清的DMEM终止消化、离心。重复多次后，组织块全部消化完。将离心后的细胞用10%的DMEM 悬浮，接种。传代时用0.25%胰酶，细胞生长非常好。楼主可以试一下。