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[分享帖]细胞消化的个人经验小结。
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一、酶消化法。
1、胰酶。这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。
2、胶原酶。这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下细胞。这种方法作用温和，对细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。
二、离子螯合剂：不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。
1、EDTA。用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度。它不能被终和。因此，消化下来的细胞要洗一遍。
2、商品化的无酶消化液。个人的使用经常觉得对细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。
三、物理法。直接吹打或用细胞刮子将细胞刮下来。
四、冷冻法。这是本人做细胞培养时发现的方法。此方法仅能用于细胞传代时。无法使组织上的细胞脱落下来。本方法的原理，我想是因细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。优点是：对细胞损伤小，不需要中止或洗细胞，方便，不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的细胞。不足是细胞常成小片脱落。此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。具体过程是：1、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5ml/孔)，2、再加0.5ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落，3、轻轻吹打，细胞即完全脱落，4、按一定比例传代。
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最新回复
04906 (2012-3-18 08:56:57)
1、EDTA。用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度。它不能被终和。因此，消化下来的细胞要洗一遍。
那么请问EDTA对pH值的影响到底是社呢们样子的呢？因为我用的胰酶传代后确实是培养基变碱了，找不到原因呢，是不是这个原因啊？我用的胰酶是０.２５％加０.０２％的EDTA
lagua123 (2012-3-18 08:57:19)
做了一段时间的皮质神经元原代培养,剪碎后的组织块消化并终止消化后吹打混匀过程中碰到两种现象:一种情况是有很粘稠的东西形成,筛子过滤时很难滤,细胞得率低;一种情况是没有或少有粘稠东西形成,液体很稀,过滤时哗哗的全滤过了,细胞得率高,但接种后杂质很多(注意不是细胞团块).现在我搞不清楚上面那种情况属于消化过度?比细胞还小的渣子是怎么形成的呢?
还有一个问题,玻璃培养瓶一般可反复使用多少次?最近一批养的细胞培养板贴壁的很好,但培养瓶却不好贴壁,总是有大量细胞浮着.
盼望高手指点迷津!万分感谢!
gogo (2012-3-18 08:59:33)
gogo (2012-3-18 08:59:50)
玻璃培养瓶从理论上说，可以无限使用。你做细胞时出现培养板贴壁好而培养瓶贴壁不好的原因与两个因素有关。一是细胞不易贴壁。因为培养板在制作时表面都会涂上易于细胞贴壁的物质，具体我也不清楚。一般的细胞都会在培养板上比培养瓶上贴壁好。另外一个原因是培养瓶清洗不够干净。如泡酸时间不够、冲洗不够干净。玻璃制品上都含有少量的有害金属离子，因此新培养瓶要泡酸以去除。旧培养瓶也要泡酸以去除上次培养遗留的物质。因此，你可以试着将泡酸的时间延长，多冲洗几遍。还有酸要定时更换。如果效果不好，可以在培养瓶上扑明胶，这样可能可以改善你的细胞贴壁的情况。明胶非常便宜。几十块钱一大瓶，够你做一辈子。方法你可以查一下。如：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3470752_1.html')
我说的冷冻法肯定有效。我做细胞培养几乎不用消化液，基本都是用这种方法传代。而且经过至少2个人5种细胞的检验。这5种细胞是：间充质干细胞、DC细胞、A549、HT29、SW480。需要注意的是PBS的温度一定要够低。
HP007 (2012-3-18 09:00:23)
胰酶在4°C放置时间不要太长，否则活性也降低。
yychen (2012-3-18 09:00:58)
请问前辈:我是新手,现在养的是bel7402,但是在消化后总是分散的很不均匀,总是有的地方几乎没有细胞,有的地方重叠生长的很厉害,我想是不是消化液不适合 啊,请问前辈有没有养过这种细胞的,给我讲一讲最适合消化液的配制方案,还有一些培养技术?请不惜赐教啊,谢谢!
小鱼鱼 (2012-3-18 09:01:14)
个人觉得单独用物理法效果不理想，尤其对于成纤维样细胞，细胞刮子只能将细胞从培养瓶或培养板上脱壁，但细胞之间的连接基质尚未破坏，故细胞间还是连接在一起的，所以刮下来的细胞还是成块的，即使用枪吹，也不容易制成单细胞悬浮液。
故建议用细胞刮子之前最好还要用胰酶处理一下。但如果你不是为了得到单细胞悬浮液，比如想从细胞里面提蛋白，那就刮吧，没问题。
fqswdzd (2012-3-18 09:01:32)
谢谢楼主，我用的就是您说的方法啊，可是消化后一会培养基还是会变硷性，不过放到第二天的时候再看培养基的颜色就变回来了，不知道是什么原因，是不是培养箱里二氧化碳的原因啊
redbutterfly (2012-3-18 09:01:49)
在培养箱中CO2就是会影响培养基 PH值的
ero11 (2012-3-18 09:02:15)
不知道上面的方法是否成立，请战友们操作反馈！先加分鼓励！
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各位,经过这么多年的验证,还有什么细胞类型得到验证可以使用这种方法?
fei1226com (2012-3-18 09:02:38)
请教一下，这个冷冻的温度是多少呢？
woshituzhu (2012-3-18 09:02:58)
请问如果我要用胶原酶从大肠癌实体组织中消化下肿瘤细胞需要在什么条件下进行？胶原酶一般的价格是多少？谢谢！
qumm1985 (2012-3-18 09:03:16)
我养的是肿瘤细胞,为了保证培养液的质量,每次换液都是现加血清和谷氨酰胺(1%),最近换液后第2天培养液就变黄了,细胞生长的也不旺盛,相反,细胞状态很不好,不知是什么原因?
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