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血清使用过程中应注意的问题
关于血清使用的几点建议
1、 血清必须贮存-20℃,如存放于4℃,请勿超过两周,对于某些单位一次无法用完一瓶,可在无菌条件下将其40-45ml分装于无菌50ml离心管中(或血清瓶中),由于血清解冻时体积会增加10%,必须预留此膨胀体积的空间,否则易发生污染或容器冻裂的情形。
2、一般公司所提供的血清一般为200ml和500ml装量,因此建议在使用中宜采取逐步解冻的方法解冻血清:-20℃→4℃冰箱或冷库溶解24小时→室温下全溶后再分装,一般以50 ml无菌离心管中分装40-45 ml。使用过程中要特别注意,必须规则地将血清摇晃均匀,小心勿造成气泡,使温度与成分均一,减少沉淀的发生。勿直接由-20℃放置至37℃环境下解冻,因为温度改变太大,溶易造成蛋白质凝结而产生沉淀。
3、血清的灭活(heat-inactivation)一般是指56℃,30分钟水浴加热已完全解冻的血清,加热过程中必须规则地摇晃均匀。此处理的目的是使血清中的补体成分(complement)去活化。但是,经过灭活处理的血清会因而造成沉淀的显著增多,且会影响血清的品质。所以,有的公司所生的细胞培养用牛血清不做灭活处理,由客户自行选择。而诊断试剂用血清在除菌过滤前进行过灭活处理。
4、在使用血清的时候,勿将血清留置于37℃太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分会因而受到破坏,影响血清的品质。
5一般我们在使用过程中是先过滤培养基,再加血清,勿直接过滤血清。
6、 血清的沉淀物
1. 凝絮物:其产生的原因有多种,但普遍的原因是血清中的脂蛋白(lipoprotein)变形及解冻后血清中存在的纤维蛋白(fibrin)造成,这些凝絮沉淀物不会影响血清本身的品质。除非必须,如果您想减少这些沉淀物,建议可用离心3000rpm,5min去除,或离心后取上清液加入培养基中一起除菌过滤。
2. 显微镜下观察“小黑点”,通常经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”,常会误认为是血清遭受污染(如黑胶虫),而将血清放置在37℃中欲培养此“微生物”,但37℃环境下,又会使此沉淀物增多,更会误认为微生物的增殖,但以培养细菌的培养基检测,又没有污染。一般而言,此小黑点不会影响细胞的生长。
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最新回复
bongte (2012-3-18 13:59:16)
1、 关于牛种
血清质量与牛种没有必然的联系,但有其先天条件。
首先,澳大利亚、新西兰的牛源之所以被国际公认为最好,原因是这些国家的牛源是“无污染”的,“无污染”的实际含义是:病毒等外源因子污染较少。至于美国,由于其国内出现了疯牛病,其形象由此受到挑战。这种血清安全性的观念在发达国家认知度较高,而在我国还不够重视。
其次,牛所能获得的营养 对血清质量有影响。在我国,由于饲养条件的不同, 不同地区产的血清质量是有差异的。
2、 质量标准件的问题
我国对人用生物制品生产所用的牛血清制定了国家标准,载于《中国生物制品主要原辅材料质控标准》2000年版,此标准已接近于国外胎牛血清的有关标准。内毒素:国家标准件为不高于10Eu/ml,内控标准件为不高5Eu/ml或10Eu/ml.国家标准之外的质控指标还有:免疫球蛋白、牛腹泻病毒(BVDV)抗体、激素、和牛源安全性验证等。
3、 牛血清的命名和选择
一般公司对细胞培养用牛血清的命名分二类:胎牛血清和小牛血清。对于一般的细胞系,小牛血清可以培养的很好。
关于牛血清白蛋白的生产工艺
牛血清白蛋白的制备方法有Cohn′s法、盐析法、热变性法等多种工艺。不同的生产工艺其产品的名称、质量指标、应用领域等各不相同。
其中Cohn′s法设备、工艺要求比较高,相对应的生产成本较高,但产品质量较好。牛血清组份V(FrationV)就是由Cohn′s法制备的。一般白蛋白纯度96-99%、外观洁白、结晶性状好、1%蛋白水溶液PH7.0±0.2,再根据不同的应用分成低内毒素、低脂肪酸等等的不产品,主要应用于细胞培养领域的无血清培养基中。盐析法因生产周期长,纯度低和产品聚合体高、稳定性低等缺陷已很少应用。
目前国内应用比较普遍的是热变性法,结合较先进的超滤生产工艺,其工艺要求相对较低,制备成本低,其缺点是目前应用领域比较单一,仅供免疫诊断试剂使用。
总结源自:cuturl('http://www.huagene.com/cp/jszc/show.asp?Shop_id=47')
cuturl('http://www.bio-equip.com/show1equip.asp?equipid=18804&division=2502')
cuturl('http://www.biox.cn/content/20050524/13990.htm')
HP007 (2012-3-18 13:59:39)
好帖。我说怎么无论怎么小心都会有黑点,而且每次PBS洗完后没有,第二天又有了,终于得到答案了,谢谢了
abc816 (2012-3-18 14:00:06)
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是过滤培养基(1640),在加血清,然后再过滤
还是加入血清后就不用过滤了啊
我有我配的冻存液(1640,小牛血清20%,DMSO10%),放在-4度保存好还是-20度保存好啊
谢谢,本人最近要冻一批细胞,每次配的话很麻烦,先配好然后直接用,不知道这样可行
bongte (2012-3-18 14:00:38)
还是加入血清后就不用过滤了啊
我有我配的冻存液(1640,小牛血清20%,DMSO10%),放在-4度保存好还是-20度保存好啊
谢谢,本人最近要冻一批细胞,每次配的话很麻烦,先配好然后直接用,不知道这样可行
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你的问题:1.我们是过滤培养基,再加灭活的血清。然后就不用过滤了.
2.你冻存液的配方是最老的,7:2:1吧。一般可以这样配。如果细胞珍贵的话,可以按血清:DMSO, 9:1配冻存液。冻存液最好现配现用,!
ending (2012-3-18 14:01:04)
谢谢楼上的!
养细胞的过程中,遇到问题的时候还是要从最基本的问题考虑起,例如楼上说的:显微镜下观察“小黑点”,通常经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”,常会误认为是血清遭受污染(如黑胶虫),而将血清放置在37℃中欲培养此“微生物”,但37℃环境下,又会使此沉淀物增多,更会误认为微生物的增殖,但以培养细菌的培养基检测,又没有污染。一般而言,此小黑点不会影响细胞的生长。
还有就有的细胞本身特性,生长繁殖快,不宜贴壁,比如一些高转移的肿瘤细胞,往往在培养过程中死细胞,脱落细胞比较多;或者血清的原因等,也会导致细胞脱落死亡,培养液浑浊,有的战友可能就会误认为是污染了。
abc816 (2012-3-18 14:01:28)
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我冻存的是儿童白血病初诊断时骨髓提取的单个核细胞,老板让先冻着,也没想好做什么!积累资源
能否给点建议,非常感谢
leifengta (2012-3-18 14:02:04)
一个简单方法判断是否有污染,那就是打开培养瓶盖闻一闻,如果有异味,那就绝对污染了
mamamiya (2012-3-18 14:02:33)
请问:1 直接过滤血清有什么弊端?
2 您用的是进口的血清吧?我们实验室用的国产血清,不过滤对细胞有影响,可能是因为血清中的有害物质。
eric930 (2012-3-18 14:03:04)
看了上述各位占有的帖子,我想的是有两个问题:
1,显微镜下观察“小黑点”,并没有指出小黑点是什么。请问,那些小黑点到底是什么?为什么会出现?是购买血清时就有的(即血清生产过程中就出现),还是购买后存放实验室的保存原因??
2,在培养过程中脱落细胞比较多;培养液浑浊,被误认为是污染。
我在细胞培养过程中也遇到了类似的问题,请问这些是什么原因??为什么会出现?
我也认为是被污染了,我的处理是直接把培养物全部丢弃掉!!
感谢您的回答,或者pm我!!
小螺号 (2012-3-18 14:03:30)
QUOTE:
我有有这样的问题,觉得是污染,肉眼看见悬浮的小球一样的颗粒3648755 (2012-3-18 14:03:56)
2、一般公司所提供的血清一般为200ml和500ml装量,因此建议在使用中宜采取逐步解冻的方法解冻血清:-20℃→4℃冰箱或冷库溶解24小时→室温下全溶后再分装,一般以50 ml无菌离心管中分装40-45 ml。使用过程中要特别注意,必须规则地将血清摇晃均匀,小心勿造成气泡,使温度与成分均一,减少沉淀的发生。勿直接由-20℃放置至37℃环境下解冻,因为温度改变太大,溶易造成蛋白质凝结而产生沉淀。
关于这一点我不认同,应该是直接由-20℃放置至37℃水浴解冻,我没有看你提供的链接.不知你来源是否权威.
我们都是用水浴,很好.而且你可能不作临床不知道临床是如何应用的,在输血科,冰冻血浆就是水浴解冻的.当然两者不同,但是血浆成份更复杂.
为了最好的保存活性物质,要用最快的速度解冻.
欢迎讨论
okhaha (2012-3-18 14:04:29)
关于这一点我不认同,应该是直接由-20℃放置至37℃水浴解冻,我没有看你提供的链接.不知你来源是否权威.
我们都是用水浴,很好.而且你可能不作临床不知道临床是如何应用的,在输血科,冰冻血浆就是水浴解冻的.当然两者不同,但是血浆成份更复杂.
为了最好的保存活性物质,要用最快的速度解冻.
欢迎讨论
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觉得是改讨论讨论,我也是直接在37度溶解的
不知道到底那种方法是正确的,或者说是合理的
我用的血清是便宜的那种
好的与差点是不是采用的方法不一样?
bongte (2012-3-18 14:05:01)
做为一名医务工作者都知道,医用血浆使用目的是扩容,在患者手术失血或创伤失血情况下,增加患者机体的供血量,起到扩容作用.
而细胞培养用的血清,我们推荐用:-20度,2-8度,37度(尽量少的时间),这样的过程,还主要是防止血清沉淀物的形成,包括一些对细胞培养有做用的多肽因子,如果从-20直接到37,那么这些多肽因子可能会发生结构变化,而导致功能失活。
所以一般的细胞培养还是推荐用梯度法,-20,2-8,37这样的步骤!以上均是个人理解,请大家发表自己的看法!
okhaha (2012-3-18 14:05:39)
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你理解上是不是有点误区啊
现在采用的成分输血,血浆中并没有血细胞的
我的理解是医用的是血浆
培养细胞用的是血清
一个是血浆,一个是血清
是不是这里面的问题
所以不一样
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