[求助]淋巴细胞从外周血中提取及淋巴细胞的培养

最新回复

• yapuyapu (2012-3-20 13:37:10)

  
  1、你可以先将上层的血浆都吸掉，然后再将中间的Ficoll层连同其中漂着的PBMC一起吸出到新的离心管中，再用缓冲液稀释离心就可以得到PBMC了。
  2、你得到PBMC后最好直接用于实验，不要在体外单独培养它。因为它是原代细胞，不会像肿瘤细胞那样在体外直接增殖的。要刺激它增殖也是有条件的。

• 缘yuan (2012-3-20 13:37:37)

  1、你可以先将上层的血浆都吸掉，然后再将中间的Ficoll层连同其中漂着的PBMC一起吸出到新的离心管中，再用缓冲液稀释离心就可以得到PBMC了。
  2、你得到PBMC后最好直接用于实验，不要在体外单独培养它。因为它是原代细胞，不会像肿瘤细胞那样在体外直接增殖的。要刺激它增殖也是有条件的。
  
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  那对那个血标本的量是不是有个最低点的要求呢？我上次拿到的血样品不足2ml，稀释后加在Ficoll上后离心2000rpm，30min，中间的PBMC的这一层白膜很少，之前看人家的说直接吸这一层，我吸不怎么好，再后面的步骤后几乎没有得到肉眼看到的细胞沉积了。希望能给点意见，我要用这个做流式，用于另一种细胞的阴性对照。谢谢！

• yapuyapu (2012-3-20 13:38:16)

  
  2ml全血中得到的PBMC的确很少，但是还是可以看到细胞沉淀的，做几管流式还是够的。
  如果细胞太少，密度梯度离心后收集细胞时可以适当增加离心速度。

• jujuba (2012-3-20 13:38:36)

  
  分离出的薄膜层用培养液洗两次，收集细胞用新鲜培养液悬浮，然后补加加新鲜培养培养液、白介二、干扰素、CD3单抗、血清培养

• kewanqi2011 (2012-3-20 13:39:04)

  2ml全血中得到的PBMC的确很少，但是还是可以看到细胞沉淀的，做几管流式还是够的。
  如果细胞太少，密度梯度离心后收集细胞时可以适当增加离心速度。
  
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  我这几天又提了几次，的确能明显发现一层白膜，我想说的是，我流式要的是淋巴细胞，而这一层除了淋巴细胞还有单核细胞，甚至可能还有红细胞，这有影响吗？应该怎么做可以将淋巴细胞的纯度提高呢？

• yapuyapu (2012-3-20 13:39:22)

  
  如果你只是想流式检测，而不是做功能实验的话，其中混有单核细胞和少量的红细胞并不会影响你的流式检测，如你想检测CD4 T细胞，用CD4抗体标记，然后将CD4阳性设门就可以了，不需要去除其它细胞。
  当然如果你的确要得到很纯的淋巴细胞，有很多方法的，你确实需要的话，我再和你说。

• zwsyrt (2012-3-20 13:39:51)

  如果你只是想流式检测，而不是做功能实验的话，其中混有单核细胞和少量的红细胞并不会影响你的流式检测，如你想检测CD4 T细胞，用CD4抗体标记，然后将CD4阳性设门就可以了，不需要去除其它细胞。
  当然如果你的确要得到很纯的淋巴细胞，有很多方法的，你确实需要的话，我再和你说。
  
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  你好，我是要用流式检测的是一个膜蛋白。具体是这样的：要检测两种不同才细胞株同一种膜蛋白的表达高低，用淋巴细胞做阴性对照，鼻咽癌细胞做阳性对照，因为已知淋巴细胞这种蛋白表达低，鼻咽癌细胞表达高。按我的实验的话，是不是单核细胞和少量的红细胞影响不是很大呢？另外，我是不是还应该在设计的时候再每一种细胞都加做一个同型对照呢？刚开始做，很多不懂，多谢您的耐心的指导哦！

• HP007 (2012-3-20 13:40:10)

  
  弄了半天，只是为了做一个阴性对照，你呀真是浪费。
  你要检测表达高低，根本不需要拿什么淋巴细胞做阴性对照，鼻咽癌细胞做阳性对照。
  直接加一个同型对照就可以检测了。

• 缘yuan (2012-3-20 13:40:40)

  弄了半天，只是为了做一个阴性对照，你呀真是浪费。
  你要检测表达高低，根本不需要拿什么淋巴细胞做阴性对照，鼻咽癌细胞做阳性对照。
  直接加一个同型对照就可以检测了。
  
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  因为之前我师兄师姐都是这样做的，所以发给我做流式的流程也是这个样子的。。。您能说具体点吗？我都开始糊涂了，呵呵，拜托了。。。

• join (2012-3-20 13:41:04)

  
  你要测膜蛋白的表达高低，直接标记流式抗体上样测就可以了呀！这不是最简单的吗？
  需要测什么细胞株就直接测该细胞株呀！
  如果要比较不同细胞株间的表达高低，就直接测这几种需要比较的就行了，这时连同型对照都可以省了。

• 缘yuan (2012-3-20 13:41:40)

  你要测膜蛋白的表达高低，直接标记流式抗体上样测就可以了呀！这不是最简单的吗？
  需要测什么细胞株就直接测该细胞株呀！
  如果要比较不同细胞株间的表达高低，就直接测这几种需要比较的就行了，这时连同型对照都可以省了。
  
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  我师姐做的时候是在食管癌标本中提细胞做的流式，她用了我上面说的对照，那我直接做细胞的话为什么就可以把对照都省了呢？

• is2011 (2012-3-20 13:42:12)

  1、你可以先将上层的血浆都吸掉，然后再将中间的Ficoll层连同其中漂着的PBMC一起吸出到新的离心管中，再用缓冲液稀释离心就可以得到PBMC了。
  2、你得到PBMC后最好直接用于实验，不要在体外单独培养它。因为它是原代细胞，不会像肿瘤细胞那样在体外直接增殖的。要刺激它增殖也是有条件的。
  
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  你好，你说的直接实验在时间上我这边不太方便，我想问下说，提出来的淋巴细胞可不可以保存一个晚上呢？如果能该怎么保存呢？可以直接用培养基悬浮后用离心管放在4度冰箱待第二天备用吗？

• DDD (2012-3-20 13:42:40)

  你好，你说的直接实验在时间上我这边不太方便，我想问下说，提出来的淋巴细胞可不可以保存一个晚上呢？如果能该怎么保存呢？可以直接用培养基悬浮后用离心管放在4度冰箱待第二天备用吗？
  
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  方法总比困难多。
  做实验时应该是你的时间去迎合实验所要求的时间，而不是实验所需要的时间来迎合你的作息时间。