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【求助】瞬时转染293T,LIPOFECTAMIN2000效率...
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我想瞬时转染293T细胞,做WESTERN,不知道lipofectamine2000效率高,还是Ca(PO4)3转的高?
有哪位大侠有经验?谢谢
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2012-9-15 14:00 作者: vcve 来源: 分析测试百科网
最新回复
misswu61 (2012-9-15 14:00:41)
vcve (2012-9-15 14:01:04)
还想问一下,你用LIPOFECTAMINE2000转293T细胞,用几孔板转的,DNA和LIPOFECTAMINE是什么比例?谢谢。
HP007 (2012-9-15 14:01:21)
xingyi08 (2012-9-15 14:01:37)
我想问问,按照LIPOFECTAMIN2000说明书上,六孔板应该加入10ul,怎么加了2ul就行呢?不太明白,能解释么?谢谢!
zsxan1990 (2012-9-15 14:01:56)
我转的每个孔1ugDNA,你也可以转的量大一点,比例就是1ugDNA:2ulLIPOFECTAMIN2000,可以做一个梯度,比如0.5ug,1ug,2ug,3ugDNA等,我做的结果是转的量太大了对细胞毒性大,所以选择了转1ugDNA
vcve (2012-9-15 14:02:13)
然后你做WESTERN了吗?成功了吗?我想做这个瞬时转染就是想做WESTERN,可总担心6孔里转的细胞不够做的,6孔里的细胞转完后,你是直接加LOADING BUFFER把293细胞吹下来的吗?加多少ul合适?全部上样吗?谢谢
问题好象就是没完没了了。呵呵。
owanaka (2012-9-15 14:02:33)
6孔板一个孔的细胞用来做Western足够了,你可以先把细胞裂解液约100ul加入细胞表面,室温作用15分钟,吹打后转入离心管,注意不要吹起气泡.离心后取上清,进行定量,然后加入上样缓冲液沸水中煮5分钟后转入冰浴,即可上样电泳.
S6044 (2012-9-15 14:02:50)
对于2楼的说法,本人持保留意见。我曾经用LIPO2000转染293t,效率也很高的,但是他的细胞毒性却是不可避免的。而磷酸钙转染对于293t细胞来说,简直如同催化剂一样,转染效率奇高,我按照2、3版分子克隆上的方法都是如此,而且他又一个任何方法都不能比拟的优点,就是很便宜,除了有点浪费质粒。附上我做的磷酸钙转染图片,绿色的为转染后表达的pegfp,仅供参考。
53357239.jpg
youyou99 (2012-9-15 14:04:10)
vcve (2012-9-15 14:04:35)
summerxx (2012-9-15 14:05:05)
QUOTE:
谢谢,我是完全按照分子克隆的protocol做的。我为了节省质粒,就用的60mm的平皿,因为蛋白表达量非常之高,而且细胞疯长,所以也就够用的。比例是10ug dna和31ul 2M CaCl2。要是做蛋白检测,作6孔板也是足够的。vcve (2012-9-15 14:05:27)
钙转的时候,我配的HBS没有调PH,有影响吗?
xingyi08 (2012-9-15 14:05:43)
我也准备做293T的瞬时转染,想先请教各位高手一个问题:你们用的质粒如果是自己提取的话,还需要纯化和精确定量吗?用的什么方法?谢谢!
qhyu (2012-9-15 14:06:07)
照片很漂亮,如果能把试验的具体详细信息告知就更好了!
我目前也在做磷酸钙转染,效率就很低,几乎观察不到!
希望加强交流,您的质粒在每孔中加多少?以六孔板为例.
谢谢!!
cxw0000 (2023-2-23 14:26:56)
cxw0000 (2023-2-23 14:26:56)
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