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【求助】单克隆挑不出怎么办
我用293细胞做转染,转染已经成功了,测过活性还可以,现在在用有限稀释法挑单克隆,但按书上的方法挑了三次都没有成功,就是将细胞稀释到10000个/ml,然后再稀释10倍,再稀释10倍,直到10个/ml,将稀释的细胞液以每孔100微升加到96孔板,但我让它长了20天都没长起来。不知道有什么技巧,请大家给点意见。 【求助】单克隆挑不出怎么办
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【求助】单克隆挑不出怎么办
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2012-9-29 11:47 作者: tianmei001 来源: 分析测试百科网
最新回复
biabiade (2012-9-29 11:47:52)
如果有细胞长不起来,有可能是折腾时间太久,细胞状态不好了。
细胞还贴壁吗?如果贴壁接换回液。
单克隆化没什么技巧。
TAT (2012-9-29 11:48:46)
单克隆荧光阳性细胞的挑选:荧光蛋白标记的细胞以荧光倒置显微镜和FACS检测荧光细胞百分比,必要时重复转染一次,有限稀释法获得荧光阳性单克隆:于96孔板中8孔为一组,每组除第一孔外其余7孔每孔加入含15%FBS的IMDM50uL(无刻度巴斯德滴管1滴),第1孔中加入100uL细胞密度为1000个/mL的含15%FBS的IMDM,即100个/孔,(以排枪)自第1孔中吸取50ul,以后每孔依次做2:1倍比稀释,丢弃最后1孔中吸出的50uL,常规培养数天~1周后于荧光显微镜下挑选eGFP+单克隆并扩增。
这个方法可以确保一定有细胞生长,如果比例足够,96孔板中至少有12~24个孔是有1个到2个细胞的,一般会有阳性孔。这种方法起始细胞数可以比较灵活,适合懒人。不象上面提及的经典方法,算得人头晕。我也没有去对过文献,自己想的。
我想,也许这种做法同样可以体现“有限稀释”的本意。
只要阳性率足够,不难。我是用逆转录病毒转的。
不知各位以为如何?
园丁## (2012-9-29 11:49:16)
乌贼老弟 (2012-9-29 11:50:00)
第一排约50cell/100ul/孔
第二排是第一排的一半
直至第十二排,
每次做两板。
这个方法好像2-3个月前在本版说过,
讨论的是真核表达的问题。
二子 (2012-9-29 11:50:26)
将玻璃吸管在酒精灯下烧至熔化,然后两头拉伸并折断一部分使其成为毛细管,在管的另一头套上一个胶管含于口中。此时准备好96孔板,并加上培养液。
在荧光显微镜下观察-选定细胞-将吸管置于细胞上-轻轻吸细胞(在镜下可看到细胞进入了吸管)-将细胞转到96板中。如此操作,选上20~30个细胞培养。然后再选择最亮的含荧光的细胞继续培养。
在此操作中:
(1)最好有一个助手帮忙,主要是在你吸到细胞后,帮助你将96孔板打开;
(2)对于无菌操作,不用太担心,只要每一步都注意一些,不会污染;
如果感兴趣可以试一试,然后在此交流一些操作上的心得,如何!
caihong (2012-9-29 11:50:56)
caihong (2012-9-29 11:51:24)
caihong (2012-9-29 11:51:58)
在挑单克隆的时候我大概总共用了半个小时不到的时间,从用胰酶消化细胞到最后放入孵箱,应该不会太长吧,在筛选稳定细胞株时我用的是800微克/毫升的G418浓度,是否在挑单克隆的时候应该减少呢?
96孔板是greiner bio-one的,用的是10%的胎牛血清,平时用它们做检测,细胞密度用20000个/孔铺板时,细胞的生长都很好的呀,应该不是这方面的问题才对.
本应该是很简单的问题,可就是挑不出来,真的很郁闷,不知道大家是否可以多点意见?
langlang (2012-9-29 11:52:27)
北京的朋友感兴趣可以问问:
Tel:82872132;Fax:62534434
831226 (2012-9-29 11:53:04)
1)胰酶消化过度。我对293细胞用0.25%胰酶+0.01%EDTA消化30秒,最多60秒,细胞就可以吹下了,EDTA是保证细胞呈单个的关键。当然细胞要清洗去掉胰酶和EDTA,洗2次更好。你是老手,相信这个问题可能性较小。
2)挑克隆前细胞的状态。建议此前不要加药,等细胞贴壁后再加药。细胞不要融合。不要用力吹打。
3)800微克/毫升的G418浓度是有效浓度还是单纯的质量/体积比,如果按G418的纯度为70%的话也有560微克/毫升了。这是事先测定了还是参考其他细胞的浓度。严谨些应先测定。每个细胞差异很大。293是人的细胞,该浓度似乎大了。
4)血清质量。单个细胞生长的要求要高的多。进口的也不一定就好。
5)载体。我们发现过某些基因对于细胞生长是有影响的,有荧光但就是不长。最后换了载体。
以上原因不会都存在,供你参考。96孔板不是问题。实验的成功往往就在于细节的把握。祝你早日成功!
c86v (2012-9-29 11:53:49)
加药?没有啊,你指的是G418吗,那不是一直都要的吗?
我用的是液体的G418,它的浓度是50毫克/毫升,每100毫升的培养液中,我加了1.6毫升。包装上好象没有关于纯度的表示。在筛选稳定细胞株时,我用的是800微克/毫升的G418浓度,细胞长得很好啊,单个细胞时,这个浓度就不行了吗?
ALALA (2012-9-29 12:16:03)
另外,我转染的细胞在挑单克隆之前是有部分出现融合的现象,而且好象传代的次数的增加,融合的程度也有增加的趋势,这是什么原因呢?是否细胞是传代的次数太多了?在转染之后,到真正开始挑单克隆,我间隔了一段时间,在这段时间内我只挑了一次单克隆(没有成功),其余转染成功的细胞我做了保种,现在是将它们复苏出来挑,这样大概在转染之后到现在挑单克隆之间我一共传了4-5代,这样是否可能就挑不出来了?
c86v (2012-9-29 12:17:34)
我建议的方法只要过膜就可以了,’
一方面防止污染,另一方面防止带进未转染的细胞。
西子 (2012-9-29 12:18:19)
过什么膜,用一般.22和.45的过滤膜,用于针筒抽滤的那种吗?也用针筒抽滤的方法吗?
c86v (2012-9-29 12:19:56)
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0.22,抽滤即可。
ALALA (2012-9-29 12:20:16)
c86v (2012-9-29 12:20:36)
好象这类药的效价问题不是很明显。
用质量没问题。
ALALA (2012-9-29 12:21:03)
ALALA (2012-9-29 12:21:21)
c86v (2012-9-29 12:21:51)
G418的赋形剂比例是是:每1mgG418粉末中含有G418纯品735ug,各公司不大一样。但差不了太多。每次称量时别忘按比例多称10/7就可以了。
不是竞争抑制,因为链霉素,庆大和G418都是氨基糖甙类药物,都要靠氨基-乙酰基转移酶来分解,
连用时会有协同作用,不过从我的经验而言,影响不大。只是注意转染时用无抗性的培养液就够了。
cuturl('http://www.jiansuo.net/cgi-bin/ut/topic_show.cgi?id=18139&h=1&bpg=1&age=0')
很多问题都讨论过了,看看吧。
【求助】单克隆挑不出怎么办