【讨论帖】Blue-Native PAGE(BN-PAGE)技术讨论

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-5-02 11:24 作者: ukonptp 来源: 分析测试百科网

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【讨论帖】Blue-Native PAGE(BN-PAGE)技术讨论

蓝绿温和胶(BN-PAGE)作为一种很好的电泳技术在蛋白质复合物的分离以及研究蛋白质与蛋白质相互作用中发挥着越来越重要的作用。在蛋白质组学日益发展的今天，越来越多的人用这项技术来研究蛋白质复合物以及亚基。大家可能会遇到各种各样的问题，希望大家能够对这项技术讨论。我做了两年的BN-PAGE，中间有不少弯路，也有一些经验，欢迎和大家交流。

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orangecake (2013-5-02 11:24:27)

还不知道什么是BN-PAGE呢？能介绍一下，或介绍几篇文献吗？
ukonptp (2013-5-02 11:25:03)

QUOTE:
原帖由 orangecake 于 2013-5-2 11:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
还不知道什么是BN-PAGE呢？能介绍一下，或介绍几篇文献吗？
温和胶，简写为BN-PAGE，由Schägger等建立的一种电泳系统，最初被用来分离牛心脏组织中线粒体上的蛋白质复合体。由于在研究蛋白复合体上的优势，BN-PAGE被用于线粒体膜、类囊体膜、质膜等膜蛋白复合体的研究。在做植物类囊体膜的电泳时，结合叶绿素的蛋白质复合物呈绿色，而不含叶绿素的呈蓝色，因此又称之为蓝绿温和胶电泳。示意图如下：

12707952.snap.jpg
bongte (2013-5-02 11:25:49)

能否请楼主介绍一下自己做BN-2D的实验目的?
并且对BN-2D上分离的蛋白质该怎样分析?
又该怎么深入?
怎么确认?
怎样排除假阳性的复合物蛋白质点?
谢谢~
ukonptp (2013-5-02 11:26:28)

QUOTE:
原帖由 bongte 于 2013-5-2 11:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

能否请楼主介绍一下自己做BN-2D的实验目的?
并且对BN-2D上分离的蛋白质该怎样分析?
又该怎么深入?
怎么确认?
怎样排除假阳性的复合物蛋白质点?
谢谢~ ...
我最开始做bn的时候是用来做一个突变体，是因为这个突变体本身具有一些生理上的特性，开始只是用过来解释为什么有这样的特性。
至于对上面的点鉴定使用的是ESI-MS/MS的方法，蛋白点基本都鉴定出来了，大部分蛋白是已经研究过的，可以解释我们想要的事情，还有些是比较特殊的，要进一步深入研究，回到经典的方法上去。
至于你说的假阳性这个问题，基本质谱结果还是要做一些生物信息学的分析，如基本的分子量什么的来排除，这个可能和2d有些相似。
通过我的结果基本bn做质谱分析的话还是做串联比较好一点，普通的maldi可能结果不会很好。
bongte (2013-5-02 11:27:04)

QUOTE:
原帖由 ukonptp 于 2013-5-2 11:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

我最开始做bn的时候是用来做一个突变体，是因为这个突变体本身具有一些生理上的特性，开始只是用过来解释为什么有这样的特性。
至于对上面的点鉴定使用的是ESI-MS/MS的方法，蛋白点基本都鉴定出来了，大部分蛋白是已经研究 ...
您老兄可能是误解我的意思了.
我是想请教,在没有实验hypothesis的情况下,
通过bn如何发现验证蛋白质复合物存在?
需要对每个蛋白质点都回到经典的方法上去研究?
似乎劳动量不少~
老兄有没有自己的一点经验和体会,
给后来人实验一点初期筛选的指导~
如4楼您贴出的mcp的paper就认为在虚线上的蛋白质点极有可能是通过对角线电泳分离的单个蛋白质点,而不是复合物上的一个组成.

还有想请问,有没有什么办法可以确认上bn前的蛋白质复合物是存在的,
也就是样品一定程度上还没有变性?
除了测酶活,还有什么办法么?
谢谢~
ukonptp (2013-5-02 11:31:21)

通过实验发现新的蛋复合物，这个我想在线粒体和类囊体里面的可能性不大，至于质膜或者细胞质中的蛋白质复合物倒是有这种可能。我想要发现一个新的蛋白复合物存在的话还是要废不少精力的，要通过bn的方法发现可能首先实验的技术就很重要，michael11兄也做了一些，要把bn本身做好，一般也就是那些别人已经发现了的，要发现新的，可能在样品的制备上要下点功夫。至于在bn上发现了新的复合物再验证的话，这个方面我还没有做过，只是一些文献的参考，做一些蛋白质蛋白质相互作用来排除假阳性，或者是co-ip，或者是细胞学的定位看是不是有复合物的可能，总之工作量应该是比较大的。
我想通过bn的方法直接发现新的复合物可能比较困难，但是通过这种方法发现一些已有复合物的未知亚基（特别是一些小分子量的），还是有可能的，这些未知的亚基也还是很值得做的。
至于上样前确定复合物的存在，这个可能没有什么更好的方法，测酶活也只是确定一个已经研究的比较透的复合物存在，还是通过bn拿到结果就知道复合物是不是存在了。
pengke1983 (2013-5-02 11:53:30)

最近数月一直在做BN，但一直没有跑出来比较满意的图。基本上第一向还可以，但转第二向后总是图上没几个点，最好的情况就是转出第一向上的2-3个条带。总体来说还是点比较少（和其他已发表了的文献上的图相比）。自己总结是样品处理的问题，本身BN的上样量有限，点不很多，而我的样品很可能上样前蛋白质的浓度就比较低。自己也想改进这一点，但不知道具体应该怎么办，希望各位能提供些好的意见，在此先表示感谢！
ukonptp (2013-5-02 11:54:01)

QUOTE:
原帖由 pengke1983 于 2013-5-2 11:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
最近数月一直在做BN，但一直没有跑出来比较满意的图。基本上第一向还可以，但转第二向后总是图上没几个点，最好的情况就是转出第一向上的2-3个条带。总体来说还是点比较少（和其他已发表了的文献上的图相比）。自己总结是样品 ...
BN对样品处理的要求还是很高的，不知道你是做什么样品的，以及你自己是怎么处理的，说出来我们好给建议。最好发出你现在做的图
gogo (2013-5-02 11:54:28)

我想请问一下, BN-PAGE实验需要特殊的仪器吗? 普通的western blot电泳设备能否用呢?
ukonptp (2013-5-02 11:55:16)

QUOTE:
原帖由 gogo 于 2013-5-2 11:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
我想请问一下, BN-PAGE实验需要特殊的仪器吗? 普通的western blot电泳设备能否用呢?
不要很特殊的仪器，只要一个能灌梯度胶的梯度混合仪和一个恒流泵就可以了。
yjf1026 (2013-5-02 11:55:45)

通过实验发现新的蛋复合物，这个我想在线粒体和类囊体里面的可能性不大，至于质膜或者细胞质中的蛋白质复合物倒是有这种可能。我想要发现一个新的蛋白复合物存在的话还是要废不少精力的，要通过bn的方法发现可能首先实验的技术就很重要，michael11兄也做了一些，要把bn本身做好，一般也就是那些别人已经发现了的，要发现新的，可能在样品的制备上要下点功夫。至于在bn上发现了新的复合物再验证的话，这个方面我还没有做过，只是一些文献的参考，做一些蛋白质蛋白质相互作用来排除假阳性，或者是co-ip，或者是细胞学的定位看是不是有复合物的可能，总之工作量应该是比较大的。
我想通过bn的方法直接发现新的复合物可能比较困难，但是通过这种方法发现一些已有复合物的未知亚基（特别是一些小分子量的），还是有可能的，这些未知的亚基也还是很值得做的。
至于上样前确定复合物的存在，这个可能没有什么更好的方法，测酶活也只是确定一个已经研究的比较透的复合物存在，还是通过bn拿到结果就知道复合物是不是存在了。

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我也在做BN-PAGE 您说很难找到新的复合物，不知道为什么啊
moonlight45 (2013-5-02 11:56:30)

梯度混合仪和恒流泵我们都没有，想用pre-cast gels，但规格难定；
有人说电泳仪不需要特殊的，有人说小型的不行……我们有17cm和8cm的两种电泳槽，选哪种更好（目前准备订pre-cast gels）？

谢谢！
zhezhe (2013-5-02 11:57:04)

近一个月以来一直在做线粒体的bn-page ,但是感觉很难的，尤其是样品的制备方面，去垢剂和蛋白质的比例方面的，不知baiy大哥有没有好的办法。还有好的文章吗，发给我
ukonptp (2013-5-02 11:57:37)

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原帖由 moonlight45 于 2013-5-2 11:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
梯度混合仪和恒流泵我们都没有，想用pre-cast gels，但规格难定；
有人说电泳仪不需要特殊的，有人说小型的不行……我们有17cm和8cm的两种电泳槽，选哪种更好（目前准备订pre-cast gels）？

谢谢！ ...
我还是建议你自己买梯度混合仪和恒流泵做，那个也不是很贵，而且这个好像没有pre-cast gels，这个和一般的sds还是有点区别的。至于胶的大小，我看不能太小也不能太大，大约10左右比较好。而且最好是那种国产的简易槽，又省电极buffer，效果也好。
ukonptp (2013-5-02 11:58:19)

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原帖由 yjf1026 于 2013-5-2 11:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
通过实验发现新的蛋复合物，这个我想在线粒体和类囊体里面的可能性不大，至于质膜或者细胞质中的蛋白质复合物倒是有这种可能。我想要发现一个新的蛋白复合物存在的话还是要废不少精力的，要通过bn的方法发现可能首先实验的 ...
我是说想在别人已经做过的样品里面发现新的复合物比较困难，比如线粒体和类囊体。
ukonptp (2013-5-02 11:59:07)

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原帖由 zhezhe 于 2013-5-2 11:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
近一个月以来一直在做线粒体的bn-page ,但是感觉很难的，尤其是样品的制备方面，去垢剂和蛋白质的比例方面的，不知baiy大哥有没有好的办法。还有好的文章吗，发给我 ...
线粒体我的感觉是样品很重要，就是拿到比较纯的线粒体比较重要，另外一个方面是拿到线粒体以后的样品处理，percoll一定要去干净，这个很影响结果。至于去垢剂和蛋白质的比例方面，这个只能是你自己的样品自己做剃度，摸索好的条件了。现在我在北京，文章什么的等回去发给你，其实应该一般的文章都有吧。
8s5g (2013-5-02 11:59:48)

请教各位,这个方法是不是针对膜蛋白的?拿来做全蛋白的话,是不是不容易分清楚?
ukonptp (2013-5-02 12:06:31)

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原帖由 8s5g 于 2013-5-2 11:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

请教各位,这个方法是不是针对膜蛋白的?拿来做全蛋白的话,是不是不容易分清楚?

bn是用来分析蛋白质复合物及亚基的，全蛋白不是很好做。
H2O (2013-5-02 12:07:53)

真的没想到有这么多战友做bn,我也做过一阶段类囊体膜的,楼上有位所贴的protocol里的图就是我老板跑的.一直还井底之蛙的以为bn只是做叶绿体和线立体膜的
最近做松树的bn遇到点问题还想请教楼主: 最后用增溶剂增溶时总是溶不下来,跑出的条带还很淡,同样的方法做拟南芥和其他植物都没有问题.这是提取的问题还是其他的问题，望赐教!
shenkunjie (2013-5-02 12:08:26)

我想问一下，在做线粒体的bn-page 时，纯化线粒体用什么梯度比较好，纯化后的线粒体还得破碎线粒体膜吗？