The use of MBP as a preferred substrate suggested that the
p48 SIP kinase might be a MAP kinase. Another hallmark of
MAP kinases is their activation via dual phosphorylation of
tyrosine and threonine residues by MAP kinase kinases
(Seger and Krebs, 1995). To determine whether the SIP kinase
was similarly activated, extracts from SA-treated cells
were subjected to immunoblot analysis, using the phosphotyrosine-
specific monoclonal antibody 4G1 O (Figure 3A).
lncreases in the amount of a phosphotyrosine-containing
48-kD polypeptide were associated with the SA-mediated
activation of the p48 SIP kinase. Furthermore, the transient
activation of the p48 kinase after SA treatment (Figure IA)
correlated with a transient increase in the level of a phosphotyrosine-
containing 48-kD protein (Figure 3A). These results
suggest that the p48 SIP kinase is a MAP kinase.
最新回复
eric930 (2013-5-11 10:52:55)
现在主流的方法是SILAC
mimili_901 (2013-5-11 10:53:13)
SILAC 主要是鉴定差异 表达蛋白的吧
LZ可以进行同源分析，或者进行domain分析看有什么结构域是属于酶的
冰儿0109 (2013-5-11 10:53:36)
QUOTE:
求详细描述我看了一下，貌似用这个方法没法确定一个蛋白是激酶
谢谢
冰儿0109 (2013-5-11 10:53:55)
QUOTE:
我也看了SILAC这个方法，貌似不太可能用来鉴定激酶啊之前的同源分析结果显示跟神经的一些蛋白同源性高，一个跨膜蛋白，可能是粘附分子
老师觉得也有可能是酪氨酸激酶
但是我没发现什么激酶的活性区域
不知道您有没有什么好的软件推荐
谢谢
finger (2013-5-11 10:54:36)
试试这个
cuturl('http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/')
紫烟 (2013-5-11 10:54:57)
The use of MBP as a preferred substrate suggested that the
p48 SIP kinase might be a MAP kinase. Another hallmark of
MAP kinases is their activation via dual phosphorylation of
tyrosine and threonine residues by MAP kinase kinases
(Seger and Krebs, 1995). To determine whether the SIP kinase
was similarly activated, extracts from SA-treated cells
were subjected to immunoblot analysis, using the phosphotyrosine-
specific monoclonal antibody 4G1 O (Figure 3A).
lncreases in the amount of a phosphotyrosine-containing
48-kD polypeptide were associated with the SA-mediated
activation of the p48 SIP kinase. Furthermore, the transient
activation of the p48 kinase after SA treatment (Figure IA)
correlated with a transient increase in the level of a phosphotyrosine-
containing 48-kD protein (Figure 3A). These results
suggest that the p48 SIP kinase is a MAP kinase.
这是我看到的一篇文献上的节选，不知道是否对你有用
rxcc33 (2013-5-11 10:55:32)
用放射性p32 ATP为供体， 用磷酸酶处理过的细胞粗提液作为底物（也可以认为是激酶的底物库substrate library）。ra然后比较auto-phosphorylation和添加你的候选激酶后的放射性活性。 如果添加后选激酶的闪烁读数significantly高于细胞粗提液的读数， 可以初步判断你的候选激酶可能是蛋白激酶。
用酪氨酸，丝/苏氨酸随机多肽库(random peptide library)作底物也行。这种随几多肽是中间的氨基酸是磷酸位点，其左右的氨基酸是随几序列。 不过要采用更高浓度比例的p32 ATP。 一般的蛋白激酶火星测试是采用p32 ATP和ATP混合体，再比例上ATP的含量>>p32 ATP的含量。
冰儿0109 (2013-5-11 10:56:06)
QUOTE:
顺便问句，我这个蛋白是膜蛋白，诱导出来都是包涵体，暂时还没纯化出天然蛋白，试问该怎么做呢？
还有一个，就是假如我把蛋白复性成功，然后使用您所说的方法。
假如我运气好，读数增加，我很幸运
但是假如读数不增加，是不是会有：1.我的蛋白不是激酶---这个我就可以放弃做这个蛋白是激酶这个思路 2.假如是我的蛋白是我复性过程中被我搞没的活性，那我该怎么拍出这个可能呢
紫烟 (2013-5-11 10:56:41)
suxiaochang (2020-8-19 09:59:03)
chenzhen2016 (2023-7-18 16:28:48)
1.检测磷酸化活性：
激酶通常具有将底物磷酸化的活性。你可以使用放射性磷或非放射性磷酸化底物来测试蛋白的磷酸化活性。通过测量底物磷酸化程度来确定蛋白是否具有激酶活性。
2.底物特异性测试：
激酶通常对特定氨基酸序列具有选择性。可以使用具有不同底物序列的肽段或蛋白来测试蛋白的底物特异性。如果蛋白只磷酸化特定序列，这可能是激酶的特征。
3.抑制实验：
使用激酶抑制剂来抑制蛋白的激酶活性，然后观察底物的磷酸化情况。如果激酶抑制后底物的磷酸化减少，这可以进一步支持该蛋白是激酶的假设。
4.基因敲除或过表达实验：
通过基因敲除或过表达蛋白，可以研究激酶对细胞信号转导的影响。观察底物磷酸化和信号通路的变化，可以验证蛋白是否是激酶。
5.反式磷酸化实验：
将激酶与特定底物一起孵育，然后用碱性磷酸酶去除残余的磷酸化。通过检测底物的磷酸化状态，可以确认激酶的活性。
6.质谱分析：
使用质谱分析确定底物或蛋白上的磷酸化位点，可以帮助确定激酶的底物和激酶的磷酸化状态。
7.结构生物学：
通过解析蛋白的三维结构，特别是其活性位点和底物结合位点，可以揭示其是否具有激酶活性。
综合以上方法的结果，你可以得出蛋白是否是激酶的结论。请注意，这些实验需要仔细的设计和控制，可能需要多种实验手段的组合来得出可靠的结论。最好在实验设计和数据解释方面与你的导师或同事进行深入讨论。祝你好运！
chenzhen2016 (2023-8-08 14:44:38)
1. 激酶活性测定： 最直接的方法是测定蛋白质的激酶活性。这可以通过体外激酶活性测定实验来完成，使用适当的底物和辅助酶。对于激酶来说，其活性会在特定条件下磷酸化底物。检测底物磷酸化程度的改变可以间接说明蛋白质是否具有激酶活性。
2. 底物磷酸化实验： 如果你知道激酶的底物是哪些，可以将这些底物用于体外磷酸化实验。在蛋白质存在的情况下，观察是否发生底物的磷酸化，这是激酶的一个特征。
3. 质谱分析： 质谱分析可以用来检测蛋白质的磷酸化状态。磷酸化会增加蛋白质的质量，因此质谱数据中出现适当的质量增加可以暗示蛋白质可能具有激酶活性。
4. 底物特异性： 激酶通常对特定的底物具有高度选择性。你可以测试蛋白质在不同底物上的活性，如果只对某些底物有活性，这可能表明蛋白质是激酶。
5. 拮抗剂实验： 尝试使用已知的激酶抑制剂（例如ATP竞争性抑制剂）来验证蛋白质是否对这些抑制剂敏感。如果蛋白质的活性受到抑制，那么可能是激酶。
6. 基因敲除或过表达： 使用基因敲除或过表达技术可以直接验证蛋白质在细胞内的功能。敲除激酶基因后，如果与该激酶相关的信号通路受到影响，那么这可能支持蛋白质是激酶的假设。
7. 生物学功能验证： 如果你能够识别激酶底物并验证其磷酸化状态的改变，那么可以观察这些底物的功能是否受到改变，从而证明蛋白质的激酶活性对细胞功能有影响。
8. 文献调研： 查阅相关文献，了解类似蛋白质是否已被鉴定为激酶，并且了解激酶的典型结构和功能特征，以便更好地进行实验设计。
请注意，综合考虑多个实验结果和分析是非常重要的，因为蛋白质的活性可能受到不同条件的影响。最好与你的导师或同事一起讨论，制定详细的实验计划来验证蛋白质是否是激酶。
chenzhen2016 (2023-8-18 16:51:17)
1. 酶活性测定： 这是最直接的方法。你可以在体外条件下，通过检测蛋白质对底物的磷酸化能力来测定其激酶活性。可以使用放射性标记的ATP或非放射性的ATP类似物来进行这个测定。
2. 底物磷酸化： 证明激酶活性的一种方法是在体外体内底物上观察磷酸化的产生。可以使用已知的底物，如蛋白质或肽段，以及相应的抗体来检测磷酸化。
3. 肽激酶反应： 你可以合成特定的肽底物，带有已知的磷酸化位点，然后观察蛋白质是否能够磷酸化这些肽。
4. 抗体检测： 利用抗体来检测蛋白质的激酶活性。例如，可以使用磷酸化特异性抗体来检测蛋白质是否磷酸化。
5. 底物特异性： 检测蛋白质是否具有特异性底物选择性。激酶通常对特定的底物具有较高的选择性，你可以测试蛋白质是否更倾向于磷酸化特定的底物。
6. 抑制实验： 使用已知的激酶抑制剂来测试蛋白质的活性是否受到抑制，这也可以作为证明的一种方法。
7. 质谱分析： 质谱分析可以帮助你确定蛋白质是否发生磷酸化。
请注意，证明一个蛋白质是否是激酶需要综合使用多种方法，而且需要进行仔细的实验设计和控制，以确保得出准确的结论。最好是和你的导师或实验室的同事进行讨论，制定详细的实验计划。
【求助】怎么证明一个蛋白是激酶呢？？