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【求助】FITC标记蛋白
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大家好，我想用FITC标记两种小肽A和B，A分子量：约3785Da，B分子量：约3108Da，发现两条多肽链中的精氨酸、赖氨酸个数分别是6个和4个，我想反应时让FITC过量一些，使游离的氨基都带上FITC，这样A和B的分子量可能就变成5900Da（加上第一个氨基酸上的氨基，共7个游离的氨基）左右和4700Da左右。我的问题主要有以下几方面：
1：反应完后选择哪种方法除去FITC？过凝胶柱？选择哪种洗脱液？FITC会不会附着在柱子上洗脱不下来？
透析？这种方法样品损失大不大？样品量本来就不多，1mg左右。
超滤？用3000Da的超滤管会损失多少样品？
2：多肽被标记上FITC后活性会不会减弱或丧失？担心这个问题！
实验做不下去了，求好心人帮忙解答一下吧。感激涕零啊，谢谢啦！
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最新回复
summerxx (2013-5-17 11:07:54)
其实我刚好也正在做这个实验，只是我标记的是蛋白，用的是sigma的F-7250.上面也是说要用G50做纯化，我们一开始也是这么做的，结果就是蛋白浓度变低。后来，我们直接用透析袋，感觉效果也差不多。
后面一个问题我感觉应该不会丧失，至少我的没丧失活性，他的原理只是在碱性AA的R基上连一个FITC分子。
如果你需要的话，我可以给你那个down下来的protocol。你给个邮箱吧。if you need。
希望可以帮到你。
ii077345 (2013-5-17 11:08:30)
QUOTE:
谢谢你的回复，我用的FITC也是sigma的F-7250，说明书我也有。你们用透析袋对蛋白的稀释厉害吗？“感觉效果也差不多”是什么意思？是效果比过G-25好还是和过G-25效果差不多？你标记的是蛋白，我的是小肽，氨基酸序列里面有多个游离的氨基的话，FITC会不会都和游离的氨基反应。我怕连上FITC后对其空间位阻有影响！
summerxx (2013-5-17 11:08:59)
效果差不多，因为我没做空间构象，只需要纯化蛋白后与细胞共培养，做endocytosis，所以只要是除去fitc就可以了。稀释情况大约是稀释了2倍，原来1ml的蛋白，后来收的时候1.8ml。测得浓度比G-25要高，偷袭了48h，每8h换了一次冰pbs。我之前也怕做错，目的蛋白也很宝贵。然后我就先买了sigma的zymosan做的FITC预实验，这个之前有人做过，然后也不贵，300-400多，后来感觉稳定了才做的目标蛋白，我想你也可以找些其他的做做预实验，然后在做实验
ii077345 (2013-5-17 11:09:27)
QUOTE:
我还想请教你个问题：你透析用的PBS的浓度和pH是多少？谢谢啦！箭头儿 (2013-5-17 11:09:57)
pH是7.4,1*的PBS
8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4
jujuba (2013-5-17 11:11:06)
额......标记单分子的FITC在末端不就完了
ii077345 (2013-5-17 11:11:40)
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你好，请问你说的“标记单分子的FITC在末端”如何实现？在末端指的是N末端吧？还有个问题想请教你：FITC标记完的多肽在4度能放多久，一个周能行吗？我看有的帖子说分装，放-20，不知可行不？能不能冻干保存？
wmp1234 (2013-5-17 11:12:03)
为什么我FITC标记15kda的抗体标不上呢？透析后也有颜色，也测到抗体，但是用470NM和532nm的滤光片测不出来
ii077345 (2013-5-17 11:12:41)
我透析后就是有颜色的，但是我没有用495和535两个波长检测，荧光显微镜观察能看到荧光标记的多肽一部分结合到细胞膜上，一部分被吞到细胞里面了！
jujuba (2013-5-17 11:13:18)
我以前也做过就是多肽直接标记FITC，像你这样的，结果裸肽活性很好，但是标记完后不能与目标特定区域结合，最后发现标记的FITC阻止了功能区域。所以除了蛋白，小肽的话建议标记单一的荧光分子。其实FAM要比FITC要稳定的，但是FITC要比FAM亮，也就是量子产率高些。
ii077345 (2013-5-17 11:13:46)
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哦，谢谢你的回复，固相合成真的好神奇！我的多肽是没有冻干，FITC标记后分装放于-20，这样能放几个周呢？谢谢！jujuba (2013-5-17 11:22:49)
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个把月应该没什么问题的，注意避光就成了，千万比较反复冻融。13799304905 (2023-3-01 13:06:04)
13799304905 (2023-3-08 16:42:19)
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FITC与多肽混合后，透析除去游离的FITC，再冻干。但是冻干得到的产物复溶，稀释到一定浓度，荧光强度仍然很大，但本来不应该那么大的，这是为什么？13799304905 (2023-3-08 16:42:19)
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FITC与多肽混合后，透析除去游离的FITC，再冻干。但是冻干得到的产物复溶，稀释到一定浓度，荧光强度仍然很大，但本来不应该那么大的，这是为什么？chenzhen2016 (2023-7-07 11:00:40)
除去FITC的方法：
凝胶柱：过凝胶柱可以用来去除未反应的FITC。您可以选择合适的柱子（例如Sephadex G-25），并使用适当的洗脱缓冲液（例如磷酸盐缓冲液）来洗脱样品。FITC通常不会强烈附着在柱子上，所以可以有效地从柱子中洗脱。
透析：透析可以用来去除未反应的FITC。将样品置于适当的透析袋中，选择适当的透析缓冲液，然后进行透析。透析的过程会使得未反应的FITC和其他小分子从袋子中扩散出去，但可能会造成一定的样品损失。
超滤：使用适当的分子量截止值为3000 Da的超滤管，可以用来去除未反应的FITC。将样品通过超滤管进行滤过，未反应的FITC和其他小分子会被滤出，但可能会损失一定量的样品。
FITC对多肽活性的影响：
FITC标记可能会对多肽的活性产生影响。这取决于具体的多肽和标记的位置。一些氨基酸残基的标记可能会影响多肽的生物活性。在实验之前，建议进行相关的文献调研，以了解是否有类似的标记实验，以及标记是否对活性产生显著影响。
建议在进行实验之前，先进行一些小规模的优化实验，以评估标记方法对多肽的影响，并根据实验结果选择最佳的除去FITC的方法。此外，咨询相关领域的专家或同行，获取更具体的指导也是一个好的选择。
chenzhen2016 (2023-8-10 10:55:52)
1. 去除FITC的方法：
* 凝胶柱层析： 这是一种常见的去除未反应的化合物的方法。你可以选择合适的分子量截留凝胶柱，如Sephadex G-25或G-50，并使用适当的缓冲液进行洗脱。由于FITC分子相对较小（389.4 Da），可能会在柱子上附着，但根据实验条件，洗脱效率可能会有所不同。你可以尝试在柱洗脱后使用一些溶剂或缓冲液来洗脱残留的FITC。
* 透析： 透析是一种有效的方法，可以在缓冲液中将未反应的FITC去除。透析可能会导致一些样品损失，但通常可以最大限度地保留目标分子。使用分子量截留透析袋（例如3,500 Da或更高）可能会有助于避免FITC的滞留。
* 超滤： 使用分子量截留为3000 Da的超滤膜可以去除未反应的FITC。在超滤过程中，可能会有一些样品损失，但与透析相比，超滤可能更快速，特别是对于样品量较小的情况。
2. 活性问题： FITC标记可能会对多肽的活性产生影响，但影响的程度会因多肽的具体性质而异。一些小肽可能对标记敏感，而另一些可能耐受标记。在实验中，最好的方法是进行活性测试，以确保标记后的多肽仍然具有所需的活性。你可以考虑进行一些适当的功能性或生物活性实验，以评估标记后的多肽是否具有所需的活性。
最终，解决这些问题需要在实验中进行测试和优化。如果你的样品量有限，你可以尝试不同的方法，然后根据结果来做进一步的选择。如果你仍然感到困惑，建议你咨询你所在领域的同行或专家，以获得更具体的建议和指导。
chenzhen2016 (2023-8-18 16:14:55)
1. FITC标记后的纯化：
标记完FITC后，你需要将未反应的FITC和其他副产物去除，以获得纯净的FITC标记多肽。几种常见的方法可以考虑使用：
凝胶过滤柱（Gel Filtration Chromatography）：这可以帮助分离FITC和标记的多肽，通常适用于相对较大的分子量的物质。柱子选择可以根据分子量来确定，同时选择合适的洗脱液。
透析（Dialysis）：透析是一种简单的方法，但如果你担心损失样品，可以考虑使用低浓度的透析袋，并根据分子量选择合适的透析液。
超滤（Ultrafiltration）：使用适当分子量的超滤管进行分离，确实可能会损失少量样品，但通常损失不会太大。选择超滤膜的分子量截止值时，要确保FITC和标记的多肽能够通过。
2. 标记后的活性问题：
FITC标记可能会对多肽的活性产生影响，特别是如果标记的位置是活性关键位点。然而，具体的影响会因多肽的结构和性质而异。标记的位置也会影响影响程度，标记靠近氨基或羧基端可能对活性影响较小。
为了确定标记是否影响活性，你可以进行一些活性测定，例如酶活性、结合实验等，与未标记的多肽进行比较。此外，也可以尝试在较小的比例下进行标记，以降低影响程度。
最终，考虑到你的样品量有限，可能需要在实验设计和优化上仔细考虑，充分利用你手头的样品来平衡标记的效率、纯化的需求以及活性的保留。如果实验过程中遇到困难，也建议在实验室内部或与同行进行讨论，以获得更多有针对性的建议。
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