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【求助】我的β-actin出好多杂带~~怎么办？
本人现在在做小鼠的肝组织的western blot，但在做内参β-actin出好多杂带，从来都没碰到这种情况，而且每次显影在55KD附近出现一条很亮的带~~怎么会出现这多的杂带啊~~盼高手能帮我解答，，不胜感激，，【求助】我的β-actin出好多杂带~~怎么办？
我用的β-actin抗体的santa的，二抗是KPL的山羊抗小鼠HRP,封闭用的是5%脱脂奶粉（TBST含0.1%吐温-20）在37°C封闭1h，一抗稀释是用封闭的牛奶，一抗稀释比为1:1000，一抗孵育条件是4°C过夜，洗脱一抗是用的TBST（含0.1%吐温-20）4*5min，二抗稀释比是1:4000，洗脱二抗用TBST5*5min
盼高手能帮我解答，，不胜感激，，！~！！！！急急急~~！！！
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最新回复
98776langtao (2013-8-03 10:46:58)
wu11998866 (2013-8-03 10:47:15)
我们实验室一般做的是43KD的actin。
3N4G (2013-8-03 10:47:49)
2抗浓度再稀释低点吧，或者吐温多加点
idea2011 (2013-8-03 10:48:07)
一抗的稀释比例太高了，内参一抗1:3000以上
idea2011 (2013-8-03 10:48:37)
还有一种可能就是一抗的问题：不是很特异。CST家就很好，Abart家的也不错
S6044 (2013-8-03 10:49:03)
我用的β-actin抗体的santa的，二抗是KPL的山羊抗小鼠HRP,封闭用的是5%脱脂奶粉（TBST含0.1%吐温-20）在37°C封闭1h，一抗稀释是用封闭的牛奶，一抗稀释比为1:1000，一抗孵育条件是4°C过夜，洗脱一抗是用的TBST（含0.1%吐温-20）4*5min，二抗稀释比是1:4000，洗脱二抗用TBST5*5min
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我觉得你换个奶粉，或者在奶粉里加上点BSA封闭1.5-2h试试！
standbyme (2013-8-03 10:49:39)
可以考虑
封闭4°C过夜，封闭液用5%BSA（TBST含0.05%吐温-20），一抗稀释用0.5%BSA（TBST含0.05%吐温-20），一抗一抗孵育条件室温2h，洗脱一抗用的TBST（含0.05%吐温-20）20min摇床上洗两次，再用TBS（不含吐温-20）摇床上洗一次，洗脱二抗同样条件。这样做可以很好的解决杂带和高背景等问题。
注：TBST及TBS一定要足量，膜放在大平皿中洗涤，TBST及TBS配方：
TBS每2000mL(pH7.4)：NaCl 16g
KCl 0.4g
Na2HPO4.12H2O 7.25g
NaH2PO4.2H2O 0.48g
TBST在TBS基础上加0.05%的Tween20。
zranqi_1 (2013-8-03 10:50:15)
我做的是人的组织，actin是兔抗人的，santa，其它条件和你几乎一样，二抗1:3000,KPL，也是在55KD处条带特别明显，43KD条带比较细。
TNT (2013-8-03 10:50:40)
用小鼠做的抗体确实是IgG含量会高，55KDa的条带很可能是重链的条带，用兔抗鼠的二抗试一试，可能会好些，我也出现过相同的现象。
孟迪科研aaa (2021-12-17 23:12:30)
孟迪科研aaa (2021-12-17 23:12:30)
chenzhen2016 (2023-7-17 16:27:21)
抗体选择和优化：
确保使用高质量的β-actin抗体，你提到是Santa Cruz的抗体，可以根据该抗体的推荐使用条件来优化稀释倍数和孵育时间。
考虑尝试其他供应商的抗体，以确认抗体的特异性和质量。
封闭缓冲液：
尝试使用1-2% BSA（牛血清蛋白）作为封闭缓冲液，而不是脱脂奶粉。有时脱脂奶粉可能导致背景信号和非特异性结合。
孵育条件和洗涤步骤：
将一抗的孵育时间缩短至1-2小时，或根据抗体说明进行优化。
在洗涤步骤中增加洗涤次数，例如使用TBST（含0.1%吐温-20）进行6-8次洗涤，每次5分钟。
二抗稀释：
考虑增加二抗的稀释倍数，例如1:5000或1:6000，以减少非特异性结合。
阻断和洗涤缓冲液的成分：
尝试不同的阻断缓冲液和洗涤缓冲液配方，例如使用BSA而不是牛奶作为阻断缓冲液，并使用0.05% Tween-20的TBST缓冲液进行洗涤。
最重要的是优化实验的每个步骤，并进行适当的负对照和阳性对照实验。根据实验结果进行微调，可能需要尝试不同的条件和试剂，直到获得清晰的目标带和最低的非特异性结合。
chenzhen2016 (2023-8-08 15:04:24)
1. Protein Extraction and Sample Preparation (蛋白质提取与样品制备)：
* 确保蛋白质提取方法正确，避免细胞裂解不完全或蛋白质降解。
* 样品制备过程中要避免过度沉淀或含有过多的溶液残留，可能会引起多条杂带。
2. Electrophoresis (电泳)：
* 确保电泳条件正确，如电流、电压和时间。
* 使用适当的电泳胶浓度和凝胶浓度，以获得清晰的分离。
3. Antibodies and Blocking (抗体和阻断)：
* 检查抗体的质量，确保其特异性和有效性。
* 确保适当的蛋白质阻断剂，如牛血清白蛋白（BSA）或非脂奶粉，用于阻止非特异性结合。
4. Secondary Antibody and Detection (二抗和检测)：
* 检查二抗的选择和稀释倍数，确保其与目标物种特异性结合。
* 检查ECL（发光底物）试剂的稀释倍数，避免过度显影。
5. Transfer (膜转印)：
* 确保膜转印条件适当，如电流和时间，以确保蛋白质转印到膜上。
* 检查蛋白转印缓冲液的配制是否正确。
6. Contaminants and Reagents (污染物和试剂)：
* 确保实验室操作干净，避免可能的污染。
* 检查所有试剂的质量，如SDS-PAGE凝胶、缓冲液、抗体等。
7. Equipment Issues (设备问题)：
* 检查电泳系统、转印系统和显影仪等设备是否正常工作，有无漏电或其他故障。
8. 数据分析和解释：
* 多条杂带可能是由于不同的蛋白异构体、剪接变异或翻译后修饰造成的。确保在分析数据时考虑这些因素。
如果你已经仔细检查了以上的步骤，仍然无法解决问题，建议你尝试重新优化实验步骤，逐步排除可能的问题源。如果问题持续存在，最好咨询实验室同事或专业人士的建议，或考虑寻求专业的技术支持。
你提供的实验步骤看起来基本上是正确的，但是问题可能出在某个步骤的细节上。以下是一些可能需要注意的点：
1. 封闭剂选择： 使用5%脱脂奶粉进行封闭是常见的方法，但有时可能会导致背景信号较高。你可以尝试使用其他封闭剂，例如3% BSA（牛血清白蛋白），以减少非特异性结合。
2. 一抗和二抗的稀释倍数： 一抗的稀释倍数看起来是合适的，但是你的二抗稀释倍数为1:4000，这可能导致信号过于强烈，可能引起背景增加。你可以尝试将二抗稀释倍数逐渐降低，例如1:5000或1:6000。
3. 洗涤步骤： 洗涤步骤非常关键，可以帮助减少背景信号。你在一抗孵育后洗脱一抗的步骤是正确的，但在洗脱二抗时，可以尝试增加洗涤次数，例如使用TBST进行更多次数的洗涤，以确保非特异性结合物质被充分洗掉。
4. 检查蛋白转印膜的质量： 确保蛋白转印膜的质量良好，没有损伤或污染。
5. 抗体质量： 尽管你使用的是Santa Cruz的β-actin抗体和KPL的二抗，但抗体的批次和质量可能会有所差异。你可以尝试使用不同批次的抗体或从其他供应商购买试剂来验证结果。
最后，问题的解决可能需要一些尝试和调整。你可以尝试一些优化的变化，单独或逐步地，以查明哪个步骤引起了多条杂带和亮带的问题。如果问题仍然无法解决，考虑咨询同事或实验室导师以获取更多的建议和帮助。
chenzhen2016 (2023-8-18 16:25:42)
1. 样品制备问题： 在西方博特实验中，样品制备是非常关键的一步。如果样品制备不当，可能会导致杂带的出现。确保你的样品制备步骤正确，包括组织裂解、蛋白浓度测定等。
2. 电泳条件问题： 不同电泳条件可能会导致带的迁移不准确，出现杂带。确保你的电泳条件（电压、时间等）是正确的，并且凝胶也是新鲜的。
3. 抗体问题： 质量不好的抗体可能会导致杂带的出现。确保使用高质量、经过验证的抗体，尤其是用于内参的抗体。
4. 封闭问题： 封闭步骤的时间和条件也可能会影响结果。确保封闭步骤充分，但不要过度封闭，以避免阻止抗体的结合。
5. 洗涤步骤问题： 洗涤步骤的次数和时间可能会影响结果。确保充分洗涤以去除非特异性结合。
6. 二抗问题： 选择合适的二抗很重要。确认你的二抗的交叉反应性较低，以避免非特异性结合。
7. 过度曝光问题： 如果显影时间过长，可能会导致非特异性结合的带变得很亮。尝试减少显影时间，以获得清晰的结果。
综上所述，你可以尝试优化实验步骤，包括样品制备、电泳条件、抗体选择和使用、封闭步骤、洗涤步骤、二抗选择等。如果问题仍然存在，可以尝试更换抗体或使用其他方法来验证结果。
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