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【求助】酵母双杂交 实验流程问题 请多指教 ！
我上个月做了 mating （酵母双杂交的一种办法）。 【求助】酵母双杂交 实验流程问题 请多指教 ！
现在已经做到了，X-gal assay。
从230多个克隆里 第一次选出了68个蓝色克隆。
第二次 挑选出了74个蓝色克隆。
可是，对比发现重复变蓝的只有 11个。
What can I do for it NEXT~
我的具体步骤是。
一 ：文库建立
1. mammalian cell total RNA --> Poly A RNA --> dsRNA --> 提纯 dsRNA。
2. 将提纯的dsRNA 转染到AH109细胞株,涂在 150ㅠ待 3~5天克隆出现 并长势饱满.
3. 每个150ㅠ， 放入5ml freezing media ，将细胞收集在一起，均匀混合，1ml 分装， -70度保存。
二 ：酵母双杂交
1 . mating , mating product 分别涂在 40个 TDO（SD/-H -L -T）， 10个 QDO( SD/-A-H-L-T) 。
2 . mating efficiency 3% 大于下限值2%。
3 . 实验步骤说明上，说3-8天克隆会出现。可是我的 大概 12天才长了出来（TDO）。
小心的将 TDO上长出来的 280个克隆，转移到TDO。
再次培养了４天左右 发现 21个在转移后没有继续长，所以淘汰掉。
４．将TDO上的克隆，转移到 QDO （for strong interaction assay ）／ 牙签上 剩下的一点点细胞 划在了100ㅠ的TDO(for colony X-a-gal filter assay) 。 双重选择，在QDO上生长，并在X-a-gal筛选中变蓝的克隆。
5. 以上方法，选出223个在 QDO 上生长的克隆。
6. X-a-gal filter assay 两次。
到这里 问题出来了 从230多个克隆里 第一次选出了68个蓝色克隆。
第二次 挑选出了74个蓝色克隆。
可是，对比发现重复变蓝的只有 11个。
而且，书上说 X-a-gal filter assay最多不要超过８小时。
可是我的克隆，基本都是在６－８小时之间 变蓝的。
请大家 一起分析一下，怎么两次 X-a-gal filter assay 变蓝的差距这么大。
难道，都是假阳性？？
我首先将两次实验重合的 11个克隆的 plasmid DNA 提了出来，正在测序。
剩下的怎么办？ 11个也太少了，之后的实验，怎么办？ 有必要 再作一次 X-a-gal filter assay么？？ 要是，又发生么变化，怎么办？？
拜托各位！！ ！
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最新回复
49888 (2013-8-16 15:09:09)
我用的试剂盒与你的一样。不过X-a-gal filter assay 我没做过，而是把在QDO上生长的菌落，挑到QDO＋X-a-gal 的平板上。一块9cm的平板等分成8份扇型区域，可以划线8个菌落。然后挑蓝色的“单菌落”抽提酵母质粒进行分析。
还有，据我发现，这个试剂盒推荐的阴性对照在TDO上也能生长，但生长速度会明显比阳性对照慢。
49888 (2013-8-16 15:09:55)
我见过别人用这个试剂盒做出过假阴性的情况，这是我后来验证的时候发现的。 我建议还是把经过X-a-gal filter assay 显阳性的菌落都划线到QDO＋X-a-gal 的平板上，看能不能得到蓝色的单菌落。
这里要注意，QDO＋X-a-gal 平板上划线需要一定的技巧，划的菌体不能太多，菌体太多得不到单菌落得。 记住，最好能得到蓝色的 单菌落。
mamamiya (2013-8-16 15:18:35)
验证的话，要再次共转化质粒入AH109，不能用以前的已经转化的。即便是阳性对照，pgadt7-t + p53,你把放置一个月的板子拿出来做显色，一样不显。酵母显色，生理活性的检测，必须make fresh.
你是做酵母融合？mate
这个我没做过，我只做过一个BD对library的。我记得mate是双库对筛的时候用的。不太推荐划线，因为曾经将阳性对照和阴性对照划同一板子，再滤纸显色，居然阴性也有点蓝，不过淡淡的，可以忽略不计。如果是筛选弱的相互作用，就最好不要。不过谁想要弱的呢，所以划一块板，也问题不大。大家慢慢切磋吧，相互进步
=pkchen= (2013-8-16 15:19:03)
我也不是特别喜欢 mating 的方法。这是老板再读PhD时，曾经用过的办法。
我们实验室，做的是 RANKL sianal 引导的 Osteoclast 分化实验室。
市场上，目前还没有 针对我们实验室体系的酵母cDNA文库.
实验室，我是第一个做酵母实验的，问都没有地方去问 (郁闷ing) 。
摸爬滚打了５个月，终于从文库做到了 Y2H的尾声。
突然间发现，分析实验结果才是最重要的。
多谢２位的回复。
我会参照的，，，谢谢，再次感谢。
zsxan1990 (2013-8-16 15:20:10)
11个还嫌少啊，关键要看这挑出来的11个单菌落测序后是不是你想要的，只要里面有一两个测序后没发生移框，是重要的基因，那往后就是一片坦途了，呵呵。
=pkchen= (2013-8-16 15:22:25)
不过，就是有点想不通。
为什么，变蓝的细胞，差距这么大。
68个，和 74个。
除了 重合的11个外。
难道是，其他的，假阳性的可能性大么？？
酵母的变化为什么这么难琢磨呢，，，似是又非是。。
3648755 (2013-8-16 15:26:23)
=pkchen= (2013-8-16 15:27:03)
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提取质粒，再转化的方法，是不是就是将我的bait和提取出来的partner --cotransfection 一次？？
或者，我打算做的是 GST pull down。
因为，我们实验室 GST pull down system 比较好。
先选出来的 11个克隆，我做了 colony PCR 发现没有多个猎物。都是一条基因。。
上面，我说的 做两次，指的是 X-a-gal filter assay 做了两次。
可是 两次，选出的 变蓝克隆，都不一样。。
酵母的可变性，假阳性的变化，难道这么大么？
还是 第一次 经历全过程，下不了肯定的结论，比较着急~~~
唉！！
guagua (2013-8-16 15:27:32)
或者，我打算做的是 GST pull down。
因为，我们实验室 GST pull down system 比较好。
先选出来的 11个克隆，我做了 colony PCR 发现没有多个猎物。都是一条基因。。
上面，我说的 做两次，指的是 X-a-gal filter assay 做了两次。
可是 两次，选出的 变蓝克隆，都不一样。。
酵母的可变性，假阳性的变化，难道这么大么？
还是 第一次 经历全过程，下不了肯定的结论，比较着急~~~
唉！！
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个人对酵母双杂交一点点肤浅的认识，仅提供给你参考。
1. 提取质粒，再转化，可以采用你说的共转，也可以交换宿主菌，再做一次mating，应该说mating比共转还是好作一些，而且更有优势；
2. GST pull down 那是需要你的诱饵蛋白和靶蛋白都能很好的表达与纯化，仅有该实验可能还是不够，因为这个是体外实验，还需要CO-IP或者FRET来进行验证，共定位只能间接说明两蛋白之间的相互作用。Humana Press有一本书叫做Protein-protein interaction，你可以仔细地选择部分章节进行参考；
3. 至于两次都不一样的情况，既然都是单基因的话，可以优先考虑共同的部分，即变蓝呈交集的部分，测序后仔细分析。
酵母双杂交从建库到筛选是件很累人的事情，这么快就能做这么好，值得鼓励，而且做的是osteoblast，那么下一步可以考虑在MSC诱导成骨过程中这些基因或蛋白的关键作用了。
个人意见，仅供参考。不足之处，请批评指正。
langlang (2013-8-16 15:30:16)
我也正在做Mating，同路人，给你一些建议：
1. 个人认为在做酵母双杂交时，目标要明确，紧盯最后的测序结果，这是你的最终目的。所以实验在做熟后，不要在某一步停留耽误时间，双杂只是整体实验方案中的第一步，找到兴趣基因后，后续的一系列验证实验才是关键。
2. 在你的实验中，先关注那11个克隆。菌落PCR的条带大小相同，不见得就是一个东西；可以把PCR产物进行酶切，看是否酶切后的条带也相同。然后把不同的克隆拿去测序看看（其实都拿去测序也不是不可，就看实验室能否承受了，毕竟测序的钱在整个实验中的比例不算大），看测出的序列是否为基因的编码序列及读码框在AD载体上是否正确（这两点都很重要）。如果有比较好的结果就马上着手进行后面的实验了（pull-down、co-IP等）。
3. 至于其他的候选结果可以慢慢验证。首先你的X-gal assay的结果其实不能说明问题，毕竟是两次非平行操作，有误差是正常的，只是你的误差确实大了点；在我的实验中反倒是通过X-gal能排除的克隆并不多，大概80-90%都变蓝；建议PCR、酶切分组后，选一些先去测序。再次共转化涂QSD平板是对的，同时做单转化AD涂QSD也是需要的（验证AD的自激活，不过基本上AD自激活的情况不多）；找到兴趣候选蛋白后互换载体共转化验证也可以（即AD-bait、BD-prey，共转化涂QSD平板及X-gal assay；当然是在时间允许的情况下可以选择做这步，但要是克隆做的不熟就算了，费时间）。基本上在酵母中的验证实验就这些了，如果有好的结果就先恭喜一下了。
4. 还有几点对于后面实验的小提示。首先筛到得基因很可能不是基因全长，如果序列包含该基因的重要结构域，可先不着急拿到基因全长，继续进行后续实验即可。同一基因在众多候选克隆中出现的次数越多，则可能性越大。找到兴趣蛋白后，体内体外的验证实验（在实验室系统成熟的情况下）应该比较顺利才对，侧面反映二者互作的可能性很大。构建载体时可添加tag，使用标签抗体便于节省时间和经费，得到较好结果后，再扩增基因全长、购买抗体（当然经费允许则另当别论）。
总而言之实验要同时开展，边找边做，找到一两个并能做出结果就相当好了；可能叙述过程中有不妥或错误的地方，还请见谅，祝实验顺利。
=pkchen= (2013-8-16 15:30:37)
感谢各位的经验之谈。。。
感觉，心里有底了。
等待的测序结果终于出来了，，，可是，DAN纯度低，，没有测出来。。。
PCR产物，直接作的测序。
因为等不及 PCR product purification Kit,,,,,,用的是gel elution kit。
结果，DNA 纯度非常差，siquencing 根本读不出来。
只能等了。
=pkchen= (2013-8-16 15:31:08)
还有，我用其他的一个 Bait 按照上述的方法，
现在已经做到了QDO , X-a-gal filter assay.....
奇怪的是，这次很成功，在TDO上长了密密麻麻的好多菌落。
在 QDO上 竟然在 mating 后的第6天，就长出了 100多个克隆。
没想到，Bait的种类不同，Y2H的结果会有这么大的差别！！！
现在，将 这 100多个克隆，重新 划了一次 QDO 2天就长满了。
X-a-gal filter assay也是 90%以上，都变蓝了。。。
今天，刚在 QDO+X-a-gal plate上，划了一遍。。。
等它也变蓝了，是不是就可以直接都测序阿。
我们教授，让我把所有的 TDO都扔了。。说是 QDO上面的意境足够了。
我至今，已在 QDO上选出了 近 300多个克隆。。
希望 各位，，给予点评！！！
谢谢！！
cwcwcww (2013-8-16 15:34:21)
感觉，心里有底了。
等待的测序结果终于出来了，，，可是，DAN纯度低，，没有测出来。。。
PCR产物，直接作的测序。
因为等不及 PCR product purification Kit,,,,,,用的是gel elution kit。
结果，DNA 纯度非常差，siquencing 根本读不出来。
只能等了。
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从酵母中提取后，可以转化大肠杆菌，然后再提取，测序。
cwcwcww (2013-8-16 15:40:47)
现在已经做到了QDO , X-a-gal filter assay.....
奇怪的是，这次很成功，在TDO上长了密密麻麻的好多菌落。
在 QDO上 竟然在 mating 后的第6天，就长出了 100多个克隆。
没想到，Bait的种类不同，Y2H的结果会有这么大的差别！！！
现在，将 这 100多个克隆，重新 划了一次 QDO 2天就长满了。
X-a-gal filter assay也是 90%以上，都变蓝了。。。
今天，刚在 QDO+X-a-gal plate上，划了一遍。。。
等它也变蓝了，是不是就可以直接都测序阿。
我们教授，让我把所有的 TDO都扔了。。说是 QDO上面的意境足够了。
我至今，已在 QDO上选出了 近 300多个克隆。。
希望 各位，，给予点评！！！
谢谢！！
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有排除诱饵的自激活么？
=pkchen= (2013-8-16 15:43:02)
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在 早先，，做 Bait transformation的时候，曾作过的。
当时，做的是 将 GBKT7 - Bait 转入 Y187...
之后 在，， SD/-Trp/X-a-Gal..SD/His/-Trp/X-a-Gal... SD/-Ade/-Trp/X-a-Gal...
上都涂抹过，，，当时都没有呈蓝色。
而且，只在 SD/-Trp 生长。。
应该算是 没有自激活吧。
=pkchen= (2013-8-16 15:43:27)
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两手都在准备。。 PCR purification kit 结果看得更快一些。。
这次，为了保险起见，已经做液体培养了，大概明天晚上 提取质粒。
在转染 E.coli。
我的 Kit 说明书上说，
要是 Bait 和 library 质粒， 各自的 antibiotics marker 不同的话，
就可以直接 转入 普通的 DH5a E.coli菌系。。
如果相同，就必须转入 KC8 E.coli。
我的 library和 bait 分别为 Kana+, Amp+，，
那是不是就说，我只要在 yeast提取出来质粒，就可以用普通的方法。
input DNA --> ice 5min--> heat shock 42度 90s --> ice 5min --> plating
转入 通的 DH5a E.coli菌系，液体培养+ antibiotics
再用一般的 质粒提纯kit 提取质粒DNA，测序。对么？？
xyw5 (2013-8-16 15:46:13)
是的，毕竟酵母里面质粒复制不如细菌快啊。
个人建议，仅供参考。
=pkchen= (2013-8-16 15:46:36)
不过，现在想想，当初做 自激活 验证实验的时候，
用的 X-a-gal 是溶解后 6个月左右的时候。活性好像不是特别好。。。
当初，是借别人的 用的。
借给我的人，说是 他上个月作过 X-gal asssay，显色没什么问题。
我不会那么惨吧~~
自激活，没有变色，是不是跟当初的 X-gal的活性降低，也有关系呢？？？
您一提起自激活， 我怎么突然打了冷颤。。
10分钟前，将 bait 划到了新的 X-gal plate上。
ukonptp (2013-8-16 16:00:41)
QUOTE:
呵呵，有时候结果太好了，也会下意识的去怀疑，做实验，有时候就是自己折磨自己，然后求得解脱的过程。
INK (2013-8-16 16:01:18)
将来会怎么样，交给阿拉去。自己做好当下的工作。实验就是充满了可变性。无需担心明天的实验结果，先生活好才最要的。
【求助】酵母双杂交 实验流程问题 请多指教 ！