【讨论帖】Western 及抗体

最新回复

• NBA (2013-9-05 15:46:14)

  
  就我的经验看，就整个Western Blot来说， 我觉得最关键的步骤在前面，1.制样 2.电泳 3.转移 4. Block，
  其中1和3更为重要， 后面的步骤按照标准来就行了， 最多有一些小调整。 你们在实际应用中有问题可问， 越具体越好。我尽量解

• 831226 (2013-9-05 16:20:23)

  蛋白的上样量有没有什么具体的要求？

• NBA (2013-9-05 16:20:52)

  
  上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western blot 则上样量要均等， 如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行 了， 但是不要超过（具体的数值我忘了，）

• NBA (2013-9-05 16:26:37)

  
  you shouldn't loading more than 0.3ug/mm2 for one well.

• xue258 (2013-9-05 16:28:25)

  
  一抗，二抗的比例还是蛮重要的

• NBA (2013-9-05 16:29:04)

  QUOTE:

  原帖由 xue258 于 2013-9-5 16:28 发表
  
  一抗，二抗的比例还是蛮重要的

  对， 调整好一抗，2抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
  大家有问题就来问吧！
  

• plaa (2013-9-05 16:29:25)

  终于有牛人了 ，我准备做western blot ，但听说很难 ，不知你那有没有较好的protocol ，我好依葫芦画瓢

• qqq111 (2013-9-05 16:29:55)

  我做WESTERN重复性很差，这一次出结果了，可是再重复做就不出阳性结果了，我反复做了好多次，就是不能每次都重复出来，而且，即使有阳性结果，条带也很浅，请问高人，是何原因？

• abc816 (2013-9-05 16:31:16)

  
  请教一下，半干转是否要求膜，3m滤纸，胶同样大小？
  因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？
  什么是短路？如何控制和发现短路呢？谢谢指点

• NBA (2013-9-05 16:31:40)

  QUOTE:

  原帖由 abc816 于 2013-9-5 16:31 发表
  
  请教一下，半干转是否要求膜，3m滤纸，胶同样大小？
  因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？
  什么是短路？如何控制和发现短路呢？谢谢指点 ...

  一般参照 膜>= 滤纸> 胶, 就行，
  
  你转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。
  
  一般Buffer和滤纸选的对就不会短路

• NBA (2013-9-05 16:32:05)

  可否把你现有的实验设备及实验条件告诉我， 我好告诉你一个比较合理的Protocol，另外，方便的化把要检测的蛋白和实验目的也告诉我好吗？

• NBA (2013-9-05 16:38:15)

  能否具体点呢？就你现在告诉我的这点情况，我很难判断，
  不过我觉得问题可能在，
  1. 制样及上样，
  2.转移。

• lixi559 (2013-9-05 16:38:36)

  
  想请教Western的结果如何分析，一定要有内参照吗？

• NBA (2013-9-05 16:38:55)

  QUOTE:

  原帖由 lixi559 于 2013-9-5 16:38 发表
  
  想请教Western的结果如何分析，一定要有内参照吗？

  不一定,但是最好能有Marker,我做的Western 都用了Marker

• lixi559 (2013-9-05 16:39:23)

  QUOTE:

  原帖由 NBA 于 2013-9-5 16:38 发表
  
  
  
  不一定,但是最好能有Marker,我做的Western 都用了Marker

  不好意思，请具体说一下该怎样分析结果，需要什么软件

• NBA (2013-9-05 16:39:45)

  QUOTE:

  原帖由 lixi559 于 2013-9-5 16:39 发表
  
  
  
  不好意思，请具体说一下该怎样分析结果，需要什么软件

  如果你做定量或办定量，至少要用到一个光密度扫描分析软件，
  如果不是，直接分析就可以了

• windy+++ (2013-9-05 16:40:05)

  我的样品制样：以上样缓冲液直接裂解细胞或是以三去垢剂裂解细胞。
  上样：每孔上样大于500000个细胞。（普通小电泳槽）
  转移：转移后以丽春红染色，可见膜上条带染色较强。
  二抗的检测：以显色剂检测，二抗没问题。
  封闭室温2小时，一抗2小时，二抗1.5小时。

• NBA (2013-9-05 16:40:28)

  QUOTE:

  原帖由 windy+++ 于 2013-9-5 16:40 发表
  我的样品制样：以上样缓冲液直接裂解细胞或是以三去垢剂裂解细胞。
  上样：每孔上样大于500000个细胞。（普通小电泳槽）
  转移：转移后以丽春红染色，可见膜上条带染色较强。
  二抗的检测：以显色剂检测，二抗没问题。
  封闭室温2小时，一 ...

  可否告知样品的分子量， 和转移方法和时间？

• windy+++ (2013-9-05 16:45:46)

  样品分子量为：170KD，转移方法：半干为25－35伏，电流小于150mA，1－1.5小时。水浴为恒流350mA,1.5小时。

• NBA (2013-9-05 16:46:09)

  170kd, 如果用半干法建议2.0mA/cm2, 时间2hrs， （7％SDS-PAGE）
  
  你的方法也可以，你一抗做了阳性对照吗？是否是你的一抗出了问题呢？