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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-9-05 15:40 作者: NBA 来源: 分析测试百科网
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原帖由 xue258 于 2013-9-5 16:28 发表 一抗,二抗的比例还是蛮重要的
原帖由 abc816 于 2013-9-5 16:31 发表 请教一下,半干转是否要求膜,3m滤纸,胶同样大小? 因为胶大小不一定规则,膜和滤纸会大一点,那样会不会短路? 什么是短路?如何控制和发现短路呢?谢谢指点 ...
原帖由 lixi559 于 2013-9-5 16:38 发表 想请教Western的结果如何分析,一定要有内参照吗?
原帖由 NBA 于 2013-9-5 16:38 发表 不一定,但是最好能有Marker,我做的Western 都用了Marker
原帖由 lixi559 于 2013-9-5 16:39 发表 不好意思,请具体说一下该怎样分析结果,需要什么软件
原帖由 windy+++ 于 2013-9-5 16:40 发表 我的样品制样:以上样缓冲液直接裂解细胞或是以三去垢剂裂解细胞。 上样:每孔上样大于500000个细胞。(普通小电泳槽) 转移:转移后以丽春红染色,可见膜上条带染色较强。 二抗的检测:以显色剂检测,二抗没问题。 封闭室温2小时,一 ...
最新回复
NBA (2013-9-05 15:46:14)
就我的经验看,就整个Western Blot来说, 我觉得最关键的步骤在前面,1.制样 2.电泳 3.转移 4. Block,
其中1和3更为重要, 后面的步骤按照标准来就行了, 最多有一些小调整。 你们在实际应用中有问题可问, 越具体越好。我尽量解
831226 (2013-9-05 16:20:23)
NBA (2013-9-05 16:20:52)
上样量要根据实验的要求来定, 如果要求是定量和半定量的Western blot 则上样量要均等, 如果只是要定性,则没有太大的关系, 尽量多上就行 了, 但是不要超过(具体的数值我忘了,)
NBA (2013-9-05 16:26:37)
you shouldn't loading more than 0.3ug/mm2 for one well.
xue258 (2013-9-05 16:28:25)
一抗,二抗的比例还是蛮重要的
NBA (2013-9-05 16:29:04)
QUOTE:
对, 调整好一抗,2抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。大家有问题就来问吧!
plaa (2013-9-05 16:29:25)
qqq111 (2013-9-05 16:29:55)
abc816 (2013-9-05 16:31:16)
请教一下,半干转是否要求膜,3m滤纸,胶同样大小?
因为胶大小不一定规则,膜和滤纸会大一点,那样会不会短路?
什么是短路?如何控制和发现短路呢?谢谢指点
NBA (2013-9-05 16:31:40)
QUOTE:
一般参照 膜>= 滤纸> 胶, 就行,你转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干是慢慢变高的, 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。
一般Buffer和滤纸选的对就不会短路
NBA (2013-9-05 16:32:05)
NBA (2013-9-05 16:38:15)
不过我觉得问题可能在,
1. 制样及上样,
2.转移。
lixi559 (2013-9-05 16:38:36)
想请教Western的结果如何分析,一定要有内参照吗?
NBA (2013-9-05 16:38:55)
QUOTE:
不一定,但是最好能有Marker,我做的Western 都用了Markerlixi559 (2013-9-05 16:39:23)
QUOTE:
不好意思,请具体说一下该怎样分析结果,需要什么软件NBA (2013-9-05 16:39:45)
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如果你做定量或办定量,至少要用到一个光密度扫描分析软件,如果不是,直接分析就可以了
windy+++ (2013-9-05 16:40:05)
上样:每孔上样大于500000个细胞。(普通小电泳槽)
转移:转移后以丽春红染色,可见膜上条带染色较强。
二抗的检测:以显色剂检测,二抗没问题。
封闭室温2小时,一抗2小时,二抗1.5小时。
NBA (2013-9-05 16:40:28)
QUOTE:
可否告知样品的分子量, 和转移方法和时间?windy+++ (2013-9-05 16:45:46)
NBA (2013-9-05 16:46:09)
你的方法也可以,你一抗做了阳性对照吗?是否是你的一抗出了问题呢?
【讨论帖】Western 及抗体