【求助】有关Triton X-114提取膜蛋白的问题

最新回复

• qumm1985 (2013-10-12 13:04:36)

  一般使用triton114含量是1-2%，除此之外还要在溶液中加入tri和nacl作为缓冲体系，你可先用配好的试剂做一个空白试验，应该是可以的
  
  先用40mmtri破碎细胞，然后再用triton114处理

• mogu (2013-10-12 13:07:32)

  
  我是在将细胞重悬在10mMTris，150mMNaCl，pH7.4的TBS中，然后加入终浓度1％的Triton X-114 。在4度混匀、离心取上清，移到37度没有预计的云雾状出现。再请问市售的Triton X-114 是液体的吗，国外的材料上好像说是固体的。

• mogu (2013-10-12 13:07:58)

  是液体的.我们用的就是一个大瓶子,纯的非常粘稠
  你是室温离心吗？

• mogu (2013-10-12 13:08:28)

  是啊。上清移到37度没有一点cloudy的感觉，然后放在室温（至少20度）5000rpm离心10min，没有分层。空白实验我也做了，就是把1ml的Triton X-114 溶解在100ml的10mMTris，150mMNaCl，pH7.4的TBS中，混匀后移到37度，没有...

• yychen (2013-10-12 13:09:12)

  
  Triton-114是很粘稠的，国内华美、生工都有分装。
  它的溶解原理是 在低温（4度）的时候溶解度高，根据有机物相似相溶的原理这时膜蛋白就会和Triton-114相溶；在37度反而溶解度低，从而将大部分Triton-114连同膜蛋白一起析出分在下层有机相。
  根据你的描述，没有分层可能有三个原因
  1.可能你用的管太大，1.5mLEp管和50mL离心管的分离效果差很多
  2.离心的时候要用水平转头，2000rpm 离心5－10min就行，离心完毕，小心取出就可以看到分层。
  3.可能你Triton-114的配制方法不对，我是将Triton-114加入TBS（10mMTris，150mM NaCl，pH7.4）中形成终浓度1%的Triton-114，保存在4度，用时直接重悬细胞，冰浴作用30分钟后放入37度作用5-10分钟（根据管子大小），水平转头离心。
  
  一些后续步骤：将上述沉淀（Triton-114与膜蛋白的混合物）加入9倍体积冰冻丙酮，冰浴40分钟，10000rpm离心20-30分钟，这时就可以将上层的丙酮和Triton-114一起去除，从而得到膜蛋白。

• mogu (2013-10-12 13:10:03)

  另外，是否可以用肉眼看到37度形成的云雾状？如果将含有1%Triton-114的TBS（10mMTris，150mM NaCl，pH7.4）从4度移到37度5min是否也能分层？

• mogu (2013-10-12 13:10:34)

  
  这也主要取决于你用的管大小，小管可以看到云雾状，大管可以看到明显的分层界限，从4度移到37度理论上来说应该也能分层。

• qumm1985 (2013-10-12 13:11:11)

  
  我用的也是1.5ml的离心管，可就是没有云雾。我的试剂是Amresco分装的，应该不会有问题。另外，为什么用水平转子，用角转子不行吗。谢谢

• yychen (2013-10-12 13:11:54)

  
  水平转头在高速旋转的时候容易使有机相和水相保持分层状态，而角转子是不可能保持两相分离的状态，自然就达不到分离膜蛋白的目的呀，两种不同转子离心原理不同啦。建议你按我上述的方法操作一遍。

• mogu (2013-10-12 13:12:20)

  还有一事请教。终浓度1％的Triton X-100的TBS作用，约1ml（置于1.5mlEP管中）离心后通常可以得到的去污剂相有多大体积？

• yychen (2013-10-12 13:15:23)

  
  有机相体积有多大，小于0.5ml吧，这很重要吗？我觉得你只要分层清晰就行了。

• vivian4123 (2013-10-12 13:15:42)

  
  沉淀（Triton-114与膜蛋白的混合物）可以直接加sds loading buffer跑SDS PAGE么？

• 831226 (2013-10-12 13:16:16)

  我用角转也能分层啊~
  你的样本中是否还有其他成分,如高浓度的盐影响分层?

• 831226 (2013-10-12 13:16:37)

  沉淀（Triton-114与膜蛋白的混合物）可以直接加sds loading buffer跑SDS PAGE么？
  
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  没问题

• greenbee (2013-10-12 13:17:16)

  我把去垢相（Tritonx-114与膜蛋白的混合物）加水调至和水相相同的体积，直接加loading buffer，跑SDS-PAGE，去垢相几乎没有什么带，水相的蛋白带很清楚，这是怎么回事啊？

• 831226 (2013-10-12 13:19:37)

  我把去垢相（Tritonx-114与膜蛋白的混合物）加水调至和水相相同的体积，直接加loading buffer，跑SDS-PAGE，去垢相几乎没有什么带，水相的蛋白带很清楚，这是怎么回事啊？
  
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  那就沉淀一下吧

• 7437654 (2013-10-12 13:19:59)

  
  请教各位战友是否膜蛋白的提取方法和胞浆蛋白的提取方法不一样?用的裂解液也不同吗?感谢

• mogu (2013-10-12 13:20:42)

  我用角转也能分层啊~
  你的样本中是否还有其他成分,如高浓度的盐影响分层?
  
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  我的裂解液是10mMTris，150mMNaCl，pH7.4的TBS，10mM的PMSF和10ug/ml的Aprotinin，盐浓度不会很高啊，不致影响分层。而且，我用纯水配成1％的TritionX114溶液，可是37度也没有cloudy。按照楼上的建议，我用水平转子离心，可是结果一样。

• 7437654 (2013-10-12 13:21:09)

  
  为什么没有人回答我的问题啊,tritionX114是那个公司的啊，那里有售，再次感谢那为高手说一下啊，急等用啊，感谢

• qumm1985 (2013-10-12 13:22:15)

  
  我也按楼上的方法做的,用丙酮沉淀以后可以看到白色的渣渣状东西,可是离心后放一会就变的透明,我师姐说那些可能是糖类,跑一向电泳,没有条带,成弥散状,就象瀑布一样,请问这是怎么回事?如何解救呢??
  我做的是酵母