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【求助】蛋白表达后条带位置与空载一样
【求助】蛋白表达后条带位置与空载一样
重组质粒测序结果正确无移码，但37°C 诱导表达后，诱导带位置居然与空载相同，降低温度到16°C ，发现在目的带位置有带，但随着诱导时间的延长，目的带越来越淡，而空载诱导带相同的地方的带却越来越浓……
换了同一系列的另一个载体也还是这样，到底为嘛啊？！！！求各位大虾指点啊！！
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【求助】蛋白表达后条带位置与空载一样
【求助】蛋白表达后条带位置与空载一样
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-10-29 17:31 作者: TAT 来源: 分析测试百科网
最新回复
vivian4123 (2013-10-29 17:31:24)
你说的是上清还是沉淀，不排除有包涵体，一般都采用低温iptg诱导，低温能好点。时间不一定长，有目的蛋白表达就行了。
huifeng0516 (2013-10-29 17:31:42)
会不会上蛋白样的时候流到了旁边那个孔？另一个就是，会不会你的空载体被少量的有基因片段的载体污染了？
TAT (2013-10-29 17:32:12)
QUOTE:
我说的是总菌…… 降低温度好像降解带那儿会淡点，但时间长了（8h）还是会降解……TAT (2013-10-29 17:32:28)
QUOTE:
上样没问题，我跑过很多次了。污染的可能性也不大，而且空载诱导后表达GST，SDS-PAGE也正好是在27左右的位置。
huifeng0516 (2013-10-29 17:33:05)
QUOTE:
这就容易解释了，GST-fusion protein经常出现的状况是，目标蛋白被完全／部分降解，结果的到稳定的GST的蛋白，这说明gst也无法帮助这个蛋白稳定表达，降解很快TAT (2013-10-29 17:33:40)
会上传图片了！！~~
83742173.snap.jpg
TAT (2013-10-29 17:33:59)
诱导条件为37°C ，IPTG 1.0mM，5h。
62934715.snap.jpg
TAT (2013-10-29 17:34:17)
后更换同一系列另一载体，37°C诱导表达后，情况同上图。
求各位大虾们指点~~~~！！！！
TAT (2013-10-29 17:34:52)
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事实上，我之前遇到一个师兄，他恰好表达过这个蛋白，用的载体也是同一个系列的，他说挺好表达的……
如果是降解，那如何解决呢？老板非要拿到这个蛋白不可啊~~~
huifeng0516 (2013-10-29 17:35:13)
16度1个小时的表达还是不错的，可以尝试纯化，并且加入protease inhibitor cocktail，以防万一，并且可以尝试on column digestion。
如果不行，那么需要尝试不同的fusion protein，以及不同的protein construct。
TAT (2013-10-29 17:35:51)
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16度1个小时的表达还是不错的，可以尝试纯化，并且加入protease inhibitor cocktail，以防万一，并且可以尝试on column digestion。
如果不行，那么需要尝试不同的fusion protein，以及不同的protein construct。
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试过冻融，然后超声，不过分离到的上清里并没有目的蛋白，感觉也是降解了……
如果要用蛋白酶抑制剂，那应该什么时候加呢？加多少呢？
为什么我的蛋白总是降解呢？！！！头痛啊~~
dog002 (2013-10-29 17:36:13)
６ＫＤ 这么小～还是先western看看？要不就换别的gel体系
TAT (2013-10-29 17:47:02)
有没有好一点的办法来分离上清和沉淀呢？
15139989695 (2023-2-11 14:32:31)
yhtfyl (2023-2-22 12:33:41)
chenzhen2016 (2023-7-07 11:06:38)
毒性效应：在37°C高温下进行表达诱导可能导致目的蛋白的毒性效应。蛋白表达过高可能对细胞产生负面影响，包括细胞死亡或蛋白的不稳定性。这可能导致目的蛋白在37°C条件下无法正常表达或稳定。
折叠和聚集问题：某些蛋白在高温下容易发生错误折叠和聚集。这可能导致目的蛋白无法正确折叠和达到稳定的构象，进而导致蛋白在表达过程中出现异常。
剪切问题：在高温下，大量的内源性蛋白合成和代谢过程会加速，从而导致目的蛋白表达受到剪切作用。这可能导致目的蛋白的表达水平下降或降解增加。
质粒拷贝数问题：在高温下，质粒拷贝数可能会增加，导致空载样品中的表达产物数量增多，而目的蛋白的表达可能受到拷贝数限制。
针对这些问题，您可以尝试以下方法：
降低诱导温度：通过将诱导温度降低到16°C等较低的温度，可以减轻目的蛋白的毒性效应和折叠聚集问题，并提高目的蛋白的表达稳定性。
优化表达条件：尝试调整诱导时间和诱导温度的组合，找到最佳的表达条件，以平衡目的蛋白的表达水平和细胞生存性。
优化质粒和宿主菌株选择：尝试不同的质粒和宿主菌株组合，以寻找适合目的蛋白表达的最佳组合。不同的质粒和宿主菌株可能对目的蛋白的表达有不同的影响。
增加抗生素浓度：在表达过程中，可以尝试增加抗生素浓度来增加目的蛋白表达的选择性，降低空载样品中的表达产物。
如果问题仍然存在，建议咨询相关领域的专家或同行，以获取更具体的建议和解决方案。
chenzhen2016 (2023-8-10 10:53:34)
1. 蛋白折叠和稳定性问题： 蛋白在不同温度下可能会折叠成不同的结构，从而影响其迁移速度和在凝胶上的迁移距离。这可能会导致你观察到的蛋白条带位置的变化。同时，蛋白在高温下可能更容易失去稳定性，从而降低其在凝胶上的迁移。你可以尝试通过添加蛋白质折叠辅助剂或者优化蛋白表达和纯化条件来解决这个问题。
2. 蛋白聚集问题： 在高温下，蛋白可能更容易发生聚集，形成大颗粒，这可能会影响其迁移行为。你可以尝试在表达过程中添加一些保护蛋白免受聚集影响的试剂，如蛋白质抗聚集剂。
3. 表达水平和毒性： 高表达水平可能会对细胞产生毒性，从而影响细胞生长和蛋白表达。这可能导致在高温下进行诱导时蛋白质表达受到抑制。你可以尝试调整诱导条件，如温度、诱导时间和诱导剂浓度，以获得更好的表达结果。
4. 降低温度对细胞的影响： 你提到在降低温度到16°C 后，目的带位置有带，但逐渐变淡。这可能是因为较低的温度可能会影响细胞的代谢活性，从而影响蛋白表达的稳定性。你可以尝试在不同的温度和时间条件下进行试验，以找到最适合蛋白表达的条件。
5. 载体相关问题： 你提到换了同一系列的另一个载体后问题依然存在。这可能意味着问题不是由于载体本身引起的，而是与细胞、表达条件或其他因素有关。
综上所述，这些问题可能是多因素共同作用的结果。解决这个问题可能需要系统性地进行实验来逐步排除可能的影响因素，并逐步优化你的表达条件。最好的方法是与你的同事或实验室的专家讨论，共同分析可能的原因并提出解决方案。
chenzhen2016 (2023-8-18 16:16:03)
1. 表达水平调节问题： 低温（16°C）诱导表达可能有助于蛋白的正确折叠，但过低的表达水平可能会导致目的蛋白在凝胶上表现为较淡的条带。你可以尝试在16°C的条件下延长诱导时间，或者尝试优化培养基和诱导条件来提高表达水平。
2. 蛋白的不稳定性： 目的蛋白可能在特定条件下不稳定，导致在较高温度诱导的情况下很快降解。你可以尝试添加蛋白稳定剂，优化蛋白的表达和纯化步骤，以保持蛋白的稳定性。
3. 胞内定位： 如果目的蛋白在细胞内定位到细胞器或其他特定位置，可能需要调整细胞的培养条件或采取其他方法来确保蛋白表达在合适的位置。
4. 质粒拷贝数： 质粒拷贝数可能影响蛋白表达水平。你可以尝试优化质粒的拷贝数，比如通过改变抗生素浓度。
5. 毒性问题： 某些蛋白可能对细胞具有毒性，导致细胞生长受限或死亡，从而影响表达结果。如果可能的话，可以尝试使用不同的宿主菌株进行表达。
6. 缺乏辅助蛋白： 有些蛋白需要特定的辅助蛋白来正确折叠和定位。你可以尝试在表达系统中添加这些辅助蛋白。
在解决问题时，建议你进行系统的优化实验，逐步排除可能的因素，同时可以考虑和实验室同事或导师讨论，获取更多建议和指导。
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