【求助】蛋白纯化遇到的问题

最新回复

• guagua (2014-6-14 16:23:37)

  
  你给的信息太简单，请将你的流动相条件，样品，色谱柱规格，流速等色谱条件给出。

• jrwyyplt (2014-6-14 16:24:07)

  
  我用的是一个His-tag纯化试剂盒，我的蛋白是用原核表达载体PET-24d在BL21中表达的蛋白，大约800bp，是表达菌株25度诱导表达6h，收集菌体，加入Bind Buffer后超生波破碎后 离心得到的上清液，过完柱子后，发现蛋白没有挂到柱子上，能给分析一下原因么？

• fei1226com (2014-6-14 16:24:27)

  
  binding buffer具体采用的是什么呀？

• jrwyyplt (2014-6-14 16:24:46)

  
  NaCl ,磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，10mmol的咪唑

• DONT (2014-6-14 16:25:03)

  你的蛋白用镍柱纯化合不合适？有文献报道过吗？是带有His-tag的吗？并不是所有的蛋白都可以用某种方法纯化的

• glass (2014-6-14 16:25:23)

  介质是不是不行了
  你的柱子是否有充分再生

• ritou1985 (2014-6-14 16:25:42)

  
  如果His标签没有完全暴露的话是有可能发生这种问题的，你可以在超声破随后的上清夜中加入一定量的尿素，至终浓度为6～8mol/L，这样可以使his标签充分暴露，有利于蛋白结合。
  另外，可以尝试一下Cu2+柱

• H2O (2014-6-14 16:25:59)

  
  换配基密度更大或者手臂更长的填料,此外提高上柱的pH,降低流速,这样应该可以改善,也可以在20mM以下做阶段洗脱,能分开就可以,因为我见过1,2,,3,4,5,6mM阶段洗脱的,优化一下吧.