【求助】请wb的高手帮忙分析

最新回复

• #甜# (2014-6-17 15:16:51)

  
  是不是抗体的问题啊?
  你把你的条件说一下

• remenb (2014-6-17 15:17:17)

  
  我也是第一次做,没有显色,不知道不显色常见的原因有哪些?
  请高手指点,不胜感激

• wmp1234 (2014-6-17 15:17:47)

  
  我也是第一次做,没有显色,不知道不显色常见的原因有哪些?
  请高手指点,不胜感激

• jrwyyplt (2014-6-17 15:18:11)

  
  其实我们做相同的指标有三次，第一次显色还可以，抗体稀释度是按说明书推荐的1：2000，第二次用的是上次回收的一抗就显色过浅，第三次是按1：1000稀释的，根本不显色。不知你说的条件包括哪些

• mamamiya (2014-6-17 15:18:41)

  1.可能是抗体的问题，结合的不好、
  2.也可能是洗膜的次数太多了，我以前做过也有这种情况。
  
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  1）既然LZ曾经做出过结果，那么就不是抗体的问题
  2）洗膜还不至于将蛋白洗掉
  另外，既然考染能看到蛋白，那么也排除电泳和抗原的问题，个人认为可能是转膜环节出现了问题，因而导致了实验的重复性不好没。
  可能情况,你电极有没有搞错,你的胶和膜的顺序对吗，有没有短路？
  建议你在转膜的时候加入预染蛋白Marker，推荐使用MBI的预染Marker，不贵才300多，0.5ml，足够做100次的。
  另外，在常规转膜后，丽春红预染一下看看，如果没有蛋白的话，接下来的环节也可以免了

• ero11 (2014-6-17 15:19:12)

  各位，大家好！最近做wb两次，一次结果是显色过浅（实验室另一位男同学不显色，但膜用考马氏亮兰显色后能看见泳道及目的蛋白的表达），请教过国外的教授，她考虑是显色剂相关问题，于是我们重配washing buffer及AP等试剂，结果这次是不显色，用考马氏亮兰显色后能看见若干条带，很不清楚，请问各位高手，问题到底在哪？实验室一大批人等着做wb呢。请各位帮忙分析一下吧。谢谢啦！
  
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  请把你的流程贴出来吧，这样很难说的。考马斯一般不染瞙的，染料染过的瞙多少会影响抗体的结合。

• remenb (2014-6-17 15:19:36)

  
  我们电转的顺序是滤纸－胶－NC膜－滤纸，胶在下，我考虑可能电极出问题。谢谢各位的帮忙。
  还请教一个问题，我们实验室的男同学用的是5％的脱脂牛奶封闭四小时后未见显色，但考染后能清晰看见泳道和目的蛋白，请问是怎么回事

• remenb (2014-6-17 15:25:05)

  
  我们的流程是：制胶（10％分离胶，浓缩胶）－电泳（待溴酚兰跑至分离胶与浓缩胶分界处电压改为200U）－裁膜（一般是去2取2）－电转（因指标分子量为45kd，故时间设定为45min，稳流）－一抗，4度过夜－二抗，摇床2h－显色（AP 10ml，NBT 66ul，BCIP 33ul）。
  另外用考染是因为显色失败当作废膜看看目的蛋白的表达，平时是不用的