【求助】western显影，发光试剂倒膜上见弥漫荧光

最新回复

• moonlight45 (2014-6-17 15:31:34)

  
  我和你遇到同样的问题，我用的也是santa的一抗，稀释度1：100.二抗1：2000。
  还有一个问题，荧光淬灭的时间是多久呢？我 用同一张膜进行了三次曝光，将发光剂用枪均匀的加在膜的正面，大概约5分钟。此时在按时肉眼观察膜上看不到任何荧光，进行曝光约10分钟，显影后可见较淡的蛋白条带，为了加强效果，进行第二次曝光，距离第一次大约20分钟，在暗室可以看见弥漫荧光，曝光后显影整个胶片是黑色的，看不见条带；第三次曝光，距离第二次大约20分钟，此时暗室观察不到膜上任何的荧光，曝光15分钟后显影胶片白茫茫一片，什么都没有，是不是在这个时间内荧光淬灭的原因呢？
  你用什么封闭的，脱脂奶粉还是BSA？

• moonlight45 (2014-6-17 15:32:06)

  
  5%脱脂奶粉1小时，目前感觉显影很恼火，影响看结果。

• fox_79 (2014-6-17 15:32:26)

  
  1.若膜上能看到荧光，压片时间就不用2分钟那么长了，10-30″足够！
  2.转膜后是否做了立春红S染色，条带清晰否？
  3.你是怎么封闭的？一抗二抗孵育多长时间？
  4.肉眼若是能看到特异性条带当然是好事。
  5.一抗也可以同时做1:10000的稀释。
  6.我用的ECL发光液在30分钟内都可显影出条带，只是弱了许多！
  愚见！

• moonlight45 (2014-6-17 15:33:38)

  
  主要问题是荧光弥漫，这个怎么产生的呢。

• tangxin_80 (2014-6-17 15:33:57)

  "1星期前，二抗之后又杂三抗"，为何要加三抗?
  分析你的情况，可能原因：一抗浓度高,过高的一抗会产生强烈的背景,不管是用BSA还是5%脱脂奶粉封闭,建议
  1.降低浓度至1:1000;
  2.发光剂AB混合液作用30S后,尽可能用吸水纸吸去多余液体;
  3.压片时间再缩短,可以短至10s-30s;
  4.在显影液里停留时间也可以短些,一出条带即中止显影.

• moonlight45 (2014-6-17 15:34:33)

  1.压片30秒也做过，显影液中就全部黑影了，根本就见不到条带。
  2.本人做的蛋白20KD，立春红染色后10－30KD之间条带不清晰，但1星期前是有条带出来的。
  3.我的蛋白－20度保存，1星期内会降解掉吗？
  4.5％脱脂奶粉室温封闭一小时，santa的一抗1：250孵育24小时或更长。二抗1：2500孵育室温1小时。
  5.杂三抗是因为二抗孵育后曝片整张片子全是不透明，白乎乎的，试验员老师说是胶片曝光了。但胶片不应该有问题，试验操作中同以前一样。考虑到膜还可以利用，就杂了三抗。

• tangxin_80 (2014-6-17 15:34:52)

  
  1、你提的是核蛋白还是浆蛋白？用什么方法处理的？蛋白在-20度保存1星期应该不会被降解，除非提蛋白过程中有污染；其他位置的条带清晰吗？如果条带均弱，可以偿试再提一次，操作在低温下进行也很重要。如果打算多次使用，要加蛋白酶抑制剂并分装；
  2、你可以增加封闭的强度，在37度1小时，以降低背景；一抗稀释度再降，如前所述；
  3、判断片子有没有曝片，在压片前剪取一个角显影后定影，如果透明就没有曝光，此外，胶片没有压到膜的区域显影后也不应该是黑的；你必须确定胶片是否曝光，否则再强的条带你都看不到结果。
  实验要不断偿试，不断排除干扰因素，预祝成功！

• c86v (2014-6-17 15:35:15)

  
  我也碰到类似问题，我的一抗1：2000（自己制备），　二抗1：5000．我觉得你除了注意上面的前辈的问题外，可以换一换洗膜液，加强洗膜条件．例如1%NP-40,0.1%SDS, 0.5%DOC 50mM Tris,150mM Nacl.结果就很好

• moonlight45 (2014-6-17 15:35:37)

  
  今天下午又做了一张，一抗使用推荐浓度1：1000（只有一个推荐浓度）4度孵育48小时，TBS×10分钟×3次，二抗1：5000室温1小时，TBS×10分钟×3次，结果同前。
  我提的是胞浆蛋白，冰上操作，蛋白加入裂解液和蛋白酶抑制剂，匀浆后未经过冰上静置裂解，直接12000g×30分钟×4度。

• moonlight45 (2014-6-17 15:36:03)

  
  不知道大家对santa抗体作WB效果的感觉怎样，听说这个公司的抗体质量不是很稳定。我作了多次都没有出来，要么弥漫荧光，要么白版一张，就是不见特意条带。

• ritou1985 (2014-6-17 15:36:23)

  
  楼主，我现在也正在做WB，也是用的SANTA　的一抗，感觉还可以，以我做的经验，我一抗　都是用的1：2000，还用过1：3000，都能做得出来，只不过后者没有前者效果好罢了，我认为你一抗杂交也不要很长时间，8－12小时足矣，二抗　我用的是1：3000，还有就是你的封闭时间我认为有点短，你封闭6－8小时再看看，如果还是不行，建议用BSA封闭，有可能牛奶封闭不全的，仅供借鉴，祝你好运！

• moonlight45 (2014-6-17 15:37:55)

  谢谢楼上，我的一抗浓度是1：100－1：200，室温下杂交2h;二抗浓度从1：1000－1：10000都试过了，杂交时间是室温下90 min；用5％脱脂奶粉封闭时间是室温 2h。一抗二抗以及脱脂奶粉的稀释液都是TBST（含吐温0.1％）。不知道您感觉我这个条件是否合适呢？

• moonlight45 (2014-6-17 15:48:34)

  
  今天试验出结果了。一抗浓度不变，二抗稀释为1：4000。
  显影液中显出条带，背景比较干净。
  考虑原因为一抗反复使用，用完后4度保存。造成抗体降解，导致弥漫荧光。
  将重复试验，以验证上述结论。

• BOSS2011 (2014-6-17 15:48:53)

  
  我也碰到类似问题,用的是SANTA的抗体,1:200,1:400,1:500,都没有做出目的条带,我是用5%脱脂牛奶,3%BSA ,1*PBS封闭过夜,一抗室温1.5小时,二抗室温40分钟,每次显影都是一片荧光.不知道班主20KD蛋白的专膜条件是什么,我做的也是小蛋白.

• moonlight45 (2014-6-17 15:49:21)

  
  "今天试验出结果了。一抗浓度不变，二抗稀释为1：4000。
  显影液中显出条带，背景比较干净。
  考虑原因为一抗反复使用，用完后4度保存。造成抗体降解，导致弥漫荧光。"
  您说的抗体降解是什么原因倒置的呢？1抗浓度过大会导致背景过高，还会引起什么结果呢？您实验用的抗体推荐浓度是1：1000，请问是santa的吗？ santa的抗体好像多数是200g/ml的，不知道您的抗体是否也是这么高的浓度？还有您的发光用的是什么，我们用的是pierce的PICA,上面推荐 用的一抗浓度是0.2－1ug/ml，而 按照santa的抗体说明书，多数是1：100－1：400。我每次用的一抗都是新鲜配置的，只想作出来一次给自己 的信心，所以回收的抗体都没有用保存着。能把您实验的一些参数拿出来大家分享吗？

• cwcwcww (2014-6-17 15:49:41)

  
  不好意思，我也是一个新手，考虑抗体降解出现弥漫荧光纯粹是自己猜想的，没有理论依据。
  我第一次作出结果是抗体新鲜配置，取的是1：200。santa的说明书是1：100－1000。二抗用的是1：2500，出来的片子背景很高。
  昨天实验出结果，一抗浓度是1：200，二抗1：4000。洗膜的次数大概是3次，40分钟。
  2次实验结果共同特点一抗新鲜配置。别的条件都一样了。之前只要是回收的一抗作出来都是弥漫荧光。当然我的回收一抗是在4度冰箱保存的。所以我想可能是这里出了问题。
  我用的膜是0.22um的PVDF膜。20V4度过夜，10小时、12小时、14小时转膜后都发现marker在膜的正反两面都有，到目前为止还没有试过同时转2张膜。这2次出结果都是转的14小时。

• moonlight45 (2014-6-17 15:50:06)

  我明天按照你的条件试试我的样品，我转磨用的是恒流40mA 14小时，或者30mA 15小时，转磨后染胶胶上仍然有蛋白条带。

• moonlight45 (2014-6-17 15:50:23)

  
  你的1抗是santa的吗？是羊抗的不？

• moonlight45 (2014-6-17 15:50:42)

  
  会不会是我们的一抗孵育时间太短呢？室温下2小时不知道够不？

• cwcwcww (2014-6-17 15:51:06)

  
  我的一抗是兔多抗。一抗4度24小时