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【求助】明胶酶图片解惑
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作明胶酶谱分析已经一个多月了，一直没有一个结果，今天跑的这个图虽然负染带较多，纵横胶片，但还是勉强能看，扫描上来又失真不少，今拿出来先描述然后请教各位，各位帮忙了，帮人一忙，胜造七级浮屠。
胶片最左边是MARK，不好意思，切胶时被毛手毛脚的师弟给MARKER切掉一多半，
勉强能看出来有3道比较亮的兰染带，最上面的是97KD，第二是66KD，下面的就不好说是多大了，因为距离已经比较远了。右边的都是跑的样品了。在97KD附近有负染带，隐约可见，97和66KD之间也有负染带的出现。现在的问题是几乎每个涌道都会出现3条负染带，但是这些带子除了92KD附近的外，位置不恒定？第二个问题更有意思，样品中有3个涌道的最下面出现比较明显的负染带，位置基本恒定在43和31KD之间（因为下面的MARKER不清楚，所以只是大概估计），请问这个负染带最可能是什么东西呢？为什么我作好几次都会出现这个带子而需要的92和72KD的带子一点都不明显呢？
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最新回复
kuaizige (2014-6-17 16:22:43)
呵呵,会不会是你的样品本身就有问题,没有你所想要的活性呢?
kuaizige (2014-6-17 16:23:07)
linlinstar (2014-6-17 16:24:40)
相关疾病：
肿瘤
我的样本应该具有酶活性的，我用的是侵袭能力很强的肿瘤细胞株，细胞长满瓶底后收集培养液然后浓缩10倍后上样作的。
linlinstar (2014-6-17 16:25:12)
你的酶谱图片我仔细看过了，上面的MMP9分子量大小没有说的，下面这两条很靠近，但是不知道你如何确定这两条那个是proMMP2呢？MMP2酶原是72KD大小，活性形势是66KD。按照您上面的说法“负染带所在地方对应的分子量比实际要小”，那么下面最明显的那条应该是MMP2？不知道我的理解对不。谢谢！
我最近看了一片文章，专门讲MMP的酶谱的，分析了酶谱过程中出现各个带子的大小已经可能代表的物质，改天给你看看。
hot_hot_hot (2014-6-17 16:25:32)
我也是做Zymography的，我不只跑出了四条带还跑出了另外几条，现在搞不清楚那几条是什么。你们的Marker是普通的蛋白质Marker吗？Marker的缓冲液是不是不加2－巯基乙醇？还有Marker是不是要煮？我用普通的蛋白质Marker，缓冲液中没有2－巯基乙醇，煮沸了五分钟，应该有六条带，但我的胶上明显的只有三条带，所以不知道哪条是哪条，郁闷中！还有Marker是不是也一样要洗要孵育啊？
你的胶中的MMP-9是在83KD的位置，照你的意思说应该是活性型了？为什么没有酶原型呢？
hot_hot_hot (2014-6-17 16:25:56)
我也是每次都会在较靠下的位置出现一条条带，而且是只要有样品就会出现，没有样品就没有，后来我用单纯用10％的小牛血清跑了一下，结果证实是血清中的蛋白。做MMP的细胞要用没有血清的培养基养，我曾经试过，但没有血清细胞就长不好，MMP分泌量很低，后来就改为1%血清，既可以给予细胞营养产生蛋白，又对MMP的检测不会产生明显的影响。
linlinstar (2014-6-17 16:26:17)
我们跑的MARKER没有煮的直接上样，上样缓冲液和样品一样，没有加DTT和2－ME。每次MARKER都跑的少一两条，也不知道是什么原因。我们判断究竟是那一条带子只能通过观察最大的那道带子然后对着MARKER说明书根据距离寻找其它带子。
今天又作一次，感觉还不错，只是还没有照相，改天拿出来大家分析分析。
xue258 (2014-6-17 16:26:34)
xue258 (2014-6-17 16:27:02)
xue258 (2014-6-17 16:27:24)
肿瘤
这是我做的胶，第四泳道两条很亮的条带中间就有好几条淡淡的条带，这是从肿瘤组织中抽提的蛋白质，估计在MMP2和9之外还有别的可以降解明胶的蛋白，各位前辈怎么看？
linlinstar (2014-6-17 16:29:03)
明胶酶条带比较多，而且从组织中和细胞培养液以及血清中的酶谱还是有些差别的，我也看了一些这方面的文章，感觉到只要抓住9和2，其他带子可以不用考虑很多的。
linlinstar (2014-6-17 16:29:21)
肿瘤
这是我做的胶，第四泳道两条很亮的条带中间就有好几条淡淡的条带，这是从肿瘤组织中抽提的蛋白质，估计在MMP2和9之外还有别的可以降解明胶的蛋白，各位前辈怎么看？
你的负染带很清楚，不知道除了明显的9和2外有没有其他的带子出来呢？你的图片仅仅显示了胶的一部分。根据我最近作的经验来看，肿瘤组织内不会仅仅出现这两条带子，应该还有其他带子的。我用的是肿瘤细胞培养液，出现了4－5条带子，多数都比较明显。在附件你可以看看。
47766746.jpg
wmp1234 (2014-6-17 16:36:32)
感觉单就酶谱法就有很多未知的和解释不清楚的东东，真是学无止境啊！提议大家把自己的心得体会还有困惑都提出来，大家一起讨论，以利于共同的进步。
wmp1234 (2014-6-17 16:36:54)
相关疾病：
黑素瘤
我用黑色素瘤细胞培养液也做过，条带很淡，不清楚，没有你的这么漂亮。请问你是什么细胞？还有你的Marker是用的什么Marker？作出来条带好不好？
linlinstar (2014-6-17 16:37:11)
相关疾病：
胰腺癌
我用的是胰腺癌细胞培养上清夜作的。MARKER都不太好，能大概定一下位而已。
喵咪 (2014-6-17 16:38:06)
我前些时候也有做过胰腺癌细胞及其他一些肿瘤细胞的MMP－2、MMP－9的明胶酶谱检测，结果还可以，一般可83KD、62KD附近分别出现二条带，Marker用的是NEB的预染Marker。在使用前沸水中煮5min，电泳完后用2.5%的Trion X-100两次，每次30min，再用50mM的Tris-HCl PH8.5,5mM的CaCl2，0.02%的A Zide)37度20－26h。然后染色的。我的蛋白样品一般是细胞传代后24h换无血清培养24h收集的上清。
喵咪 (2014-6-17 16:38:43)
linlinstar (2014-6-17 16:38:59)
我前些时候也有做过胰腺癌细胞及其他一些肿瘤细胞的MMP－2、MMP－9的明胶酶谱检测，结果还可以，一般可83KD、62KD附近分别出现二条带，Marker用的是NEB的预染Marker。在使用前沸水中煮5min，电泳完后用2.5%的Trion X-100两次，每次30min，再用50mM的Tris-HCl PH8.5,5mM的CaCl2，0.02%的A Zide)37度20－26h。然后染色的。我的蛋白样品一般是细胞传代后24h换无血清培养24h收集的上清。
您详细说明一下吗？后来我再作了几次，感觉MMP2不是很好，可能与酶的活性降低有关。“一般可83KD、62KD附近分别出现二条带”能具体说明一下吗？我后来作的是116KD，92KD的比较明显，而72KD以及其活性型66DKD的不明显，谢谢！
orangecake (2014-6-17 16:39:59)
那个预染Marker确定好用吗?一定能跑出条带？我已经定过两次普通蛋白质Marker了都没跑好，要是再买了跑不好老板会骂死我的！
linlinstar (2014-6-17 16:40:18)
感觉作蛋白比核酸要困难多了，核酸的MARKER以及跑带等非常容易，作蛋白问题太多了，单单就MARKER一个就有很多问题，有的MARKER不准，有的容易降解，有的带子很宽，有的个别带子跑不出来。而蛋白电泳每次又耗时耗精力耗钱，真的让人郁闷。
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