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【求助】关于用酶谱分析来测蛋白酶活性的一个问题
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就是 如果我复性一个融合蛋白(蛋白酶)成功后准备测活,打算用酶谱分析方法来检测,不知道酶谱分析是不是只适合于明胶酶谱,还是也可以测好多其它的蛋白酶的活性?酶谱分析在分离胶中检测酶活应该是一起跑变性凝胶电泳(加了SDS)再复性显色脱色,还是先跑酶的非变性活性凝胶电泳再加底物显色脱色?
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最新回复
H2O (2014-6-17 17:54:50)
应你一下:)
MMPs根据其结构和底物特异性不同可分为5大类:①间质胶原酶,包括MMP-1、-8、-13、-18,主要降解Ⅰ~Ⅲ型胶原及Ⅶ和Ⅹ型胶原,不能降解明胶、Ⅳ型和细胞外基质的其它蛋白成 分。胶原酶以潜酶原方式合成。MMP-1(Mr=54×103)是成纤维细胞、巨噬细胞、上皮细胞等细胞来源的成纤维细胞型胶原酶。而MMP-8(Mr=75×103)是由中性白细胞 合成分泌的中性白细胞胶 原酶;②Ⅳ型胶原酶,也叫明胶酶,包括明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B (MMP-9)。明胶酶 具 有降解变性Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原明胶的特异能力,也可切割天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型胶原;③基质溶解素,包括基质溶解素-1 (MMP- 3)、基质溶解素-2(MMP-10)和基质溶解素-3(MMP-7);④膜型MMPs,包括MT1-MMP(MMP-14)、MT2-MMP(MMP-15)、MT3-MMP(MMP-16)以及近来分离命名的MT5-MMP。这种酶表达于细胞表面,除可直接降解基质,还对MMP-2和MMP-13有激活作用;⑤其它类,包括MMP-4、-5、-6、-20。这些未归类MMPs的作用较特殊,不能归类于其它MMPs。
所以明胶酶谱适合于做MMP2和MMP9。
至于跑胶时变不变性的问题,跑普通的SDS-PAGE胶前是加入了去垢剂和还原剂的,将蛋白的二三级结构全部打开,只保留线性的一级结构,以确保可以确定分子量的大概大小,但这样的蛋白通常失去了正常状态下的生物活性,显然对于酶谱法是不适合的。我做酶谱法时,是用非变性的上样缓冲液与样品混合后直接上样,效果很好,活性正常。跑完胶后用考马斯亮蓝染色,观察酶的活性情况。
祝实验顺利,有问题再交流:)
969 (2014-6-17 18:04:31)
H2O (2014-6-17 18:04:53)
对啊,我说的MMP就是你要做的金属蛋白酶,根据不同分型选择不同底物,我没有听说caein是通用底物啊,一般经典的是检测MMP2与MMP9,用的是明胶gelatin,caein酪蛋白酶谱法可用来检测MMP3及MMP12等,所以关键还是要看你想检测的是MMP中的哪种分型。
969 (2014-6-17 18:05:08)
酱紫的啊,如果我要检测的不是MMP中的哪种分型,不是胶原酶而是一般的蛋白酶呢,可不可以用这个方法?
mamamiya (2014-6-17 18:05:29)
jrwyyplt (2014-6-17 18:05:46)
casin 也是一种很常用的底物啊,主要还是看你的蛋白的性质,就算是普通蛋白酶也有好多种,到底多普通?casin也同明胶一样走酶谱的。
969 (2014-6-17 18:06:05)
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