【求助】动物和酵母质膜囊泡的标记蛋白种类

最新回复

• am10 (2014-6-17 18:09:42)

  我是一直做植物的，对动物和酵母知道的很少，请园子里懂行的帮帮忙吧！也请版主多号召一下吧！
  任何建议都将感激不尽！

• fsdd817 (2014-6-17 18:10:13)

  建议看看，
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=6292909&sty=1&tpg=6&age=0')，
  膜上的标记蛋白质比较多，
  但是又要参与胞吞和胞吐过程的囊泡上的保守蛋白，就不太清楚了。
  参考相关文献吧

• am10 (2014-6-17 18:11:03)

  据我了解，植物细胞膜上没有Na/K泵，只有Na/H或K/H泵。况且ATPase活性是质膜上的，囊泡膜上不知有没有？所以我想用分泌到细胞膜的囊泡上的外被蛋白（coat protein），比如 COP II 做标记蛋白，不知是否可行？请指教！

• whitesheep (2014-6-17 18:11:20)

  
  我作人源细胞的分泌性囊泡，不知是否对你有帮助

• am10 (2014-6-17 18:11:39)

  谢谢你的参与！不知你有什么好建议，尽管提。
  我老板就是让我参考动物和酵母的来做。我所需要的是定位于囊泡膜上的跨膜蛋白，无论有什么功能都行，但是希望是功能保守的，可能在植物里也存在的蛋白。这样我才能在植物中得到，也才能进行下一步研究。
  另外，请教个问题：跨膜蛋白的Linker指的是哪一段啊？是跨膜区近处的区段吗？请指教！谢谢！

• whitesheep (2014-6-17 18:12:01)

  战友别客气，互相帮忙。
  对于人源性的细胞来说，囊泡的分离有两种办法。如果囊泡位于细胞内部，那么首先裂解细胞，使得囊泡能够释放到细胞外。然后，任何含有质膜的囊泡性结构在100000g的超速离心下可以沉淀下来。如果囊泡分泌到细胞外，比如培养液中，那么直接将培养液离心就能沉淀囊泡。
  离心力的选择很重要，一般而言，300－500g能够使细胞沉淀，800g能够沉淀细胞碎片，5000－10000g左右能够沉淀线粒体、高尔基体、过氧物酶体等质膜结构的囊性细胞器。但是，如果是质膜结构的囊泡性结构，则需要100000－110000g的离心力。再大就会有蛋白质复合体、核酸什么的沉淀了。我做人腹水中的一种细胞分泌的小囊泡，直径50－100nm，就是用100000g离心1小时得到。这时仍混有一些杂质，但纯度还可以。
  得到囊泡后，关键是你不知道需要什么蛋白。你可以将囊泡用非离子去垢剂（如尿素、CHAPS）使质膜溶解，然后将膜蛋白进行双向电泳，再用质谱鉴定都有那些蛋白。找到你感兴趣的蛋白后，在做下一步研究。
  最后一个问题不懂，请别的战友回答。

• am10 (2014-6-17 18:12:20)

  
  谢谢指点！
  你的方法很明确，但是我还有一些问题。通过离心分离囊泡后，怎么鉴定纯度呢？显微镜观察好象还不够吧？是不是还需要做Western 杂交来鉴定呢？这时你选择什么蛋白来杂交呢？或者还有其他的方法？
  我要做的囊泡直径为50nm或300nm。100000g应该没问题吧？

• whitesheep (2014-6-17 18:12:40)

  纯度鉴定可以现在电镜下看一看杂质有多少，大概估计一下纯度。然后需要知道可能会有哪些杂质，比如线粒体碎片，那么用western看看有没有线粒体特异的膜蛋白。这一点挺难的，因为可能我们根本不知道杂质会是什么，或者杂质没有特异蛋白。还有一种办法，就是知道那种囊泡有没有肯定不出现的蛋白，而别的杂质含有的蛋白，那么用western测一下那种蛋白就行。比如在我的实验中，分离的囊泡在50kd以下的区段是没有泛素表达的，而泛素是细胞内广泛出现的蛋白，所以我就测有没有泛素，如果有，那么将泛素的浓度和总蛋白浓度一比，就知道杂质的含量了。别的办法我也没有了，问问别的大侠吧。
  还有，所谓纯度只能是一个相对的概念，不可能百分之百纯。我想最重要的还是要知道离心后一道沉淀的都是些什么东西，如果用100000g离心，在人类细胞绝大多数都是质膜囊泡，有少部分的细胞膜碎片、凋亡小体、线粒体碎片、内质网碎片。其实，如果你将沉淀全部作质谱，那么就大概知道都有那些膜相关或者膜特异蛋白了。
  50nm100000g应该可以了，300nm可能不需要那么大就能沉淀，这取决于两者的沉降系数，直径的影响不是主要的。说白了，越重越容易沉淀。还要考虑的是离心时间，我用1小时就够了，但是也有离心过夜的，这个你得查查文献了。或者自己用不同得时间试一试。如果你知道待分离囊泡的密度，那么使用密度梯度离心可以将纯度大大提高。另外，离心时一定要小于等于4度，不然蛋白容易降解。
  祝顺利

• am10 (2014-6-17 18:13:02)

  如果我能找到像你那样的囊泡中不存在的蛋白就好了。可惜我目前掌握的资资料中还找不到。看来我得继续寻找了。
  另外，你所说的100000g离心，是用蔗糖密度离心吗？浓度是多少啊？

• whitesheep (2014-6-17 18:13:28)

  我分离的囊泡密度是1.19-1.21之间，所以用30％的蔗糖重水溶液。就是将3g蔗糖溶于10ml重水即可。离心时蔗糖溶液（5ml）放在离心管的最底层，上面铺待分离的液体30ml。这也是我从国外文献上看来的，你要的囊泡是不是合适，我不太清楚。
  我想酵母或者植物细胞应该比人类细胞简单，比如某些细胞器是没有的，那么鉴定时你可以分两步走，1、WB鉴定囊泡应该有的蛋白；2、WB鉴定杂质蛋白，比如线粒体、高尔基体（低等生物是不是没有？）、溶酶体、过氧物酶体、内质网，这几项我觉得应该差不多了