【求助】溴酚兰以上部分银染背景太高的原因？

最新回复

• yes4 (2014-6-18 10:49:32)

  
  可能是电极buffer不太干净，应该与发热没什么关系，最好贴上图，再说说你的具体条件。

• fox_79 (2014-6-18 10:50:58)

  , 是新配的电泳缓冲液. 倒是配好放了几天再用的.
  扫描仪坏了,还没修回来,图没法贴.
  用了Bio-rad 的 PROTEAN II xi 二向电泳仪. 电压80V 45min, 200V, Unlimited(实际跑了5:30h)
  不知道跟这个有关的具体条件包括哪些?还请指点

• yes4 (2014-6-18 10:52:04)

  
  我用同样的电泳仪的条件：先4mA/胶 进样30-40分钟,然后25mA/胶 跑4小时40分钟,没用恒温水浴,或者在层析柜中跑。

• fox_79 (2014-6-18 10:52:30)

  如果没有放层析柜中跑,电泳完有没有觉得玻璃都是烫的?
  前几天气温高,跑完玻璃一边都裂了.
  电泳没有冷凝的话,对电泳结果有什么影响吗?

• yes4 (2014-6-18 10:52:57)

  个月前 我在室温下、未用了恒温水浴的情况下跑过几块，玻璃是热的，但不烫。跑胶条件和我以上说的几乎一样。
  电泳没有冷凝的话,对电泳的影响应该就是所谓的微笑现象。但是我觉得不是个很严重。 另外可能还有可能促进蛋白点的扩散。

• gogo (2014-6-18 10:53:16)

  
  1."2向SDS-PAGE时产热厉害" ----可使蛋白扩散
  2.银染试剂的量和时间要精确,有时多几秒就不好
  3.提前终止.个人感觉加终止液后胶还是会缓慢显色约1min的

• fox_79 (2014-6-18 10:53:46)

  请看这副图,因为同一胶,溴酚蓝以下部位没有染黑,所以,跟银染时间,用量和终止都没有关系.而且,所用的染色条件和我原来染出是好的条件是一致的.
  加在旁边的marker部位也被染成黑色,所以跟一向没有关系.
  自己分析可能的原因是:电泳缓冲液, 封胶用琼脂糖凝胶 或电泳产热有关系. 希望有相关经验的战友提供帮助.谢谢

  
  15339775.jpg

• fox_79 (2014-6-18 10:54:15)

  染出的胶用相机拍出的效果是这样的,大家再帮忙分析一下,谢谢

  
  60073835.jpg

• ending (2014-6-18 10:54:42)

  封胶琼脂糖的问题，
  重新配吧，
  加热时小心别污染，
  最好别配太多，
  放久了不污染也会这样的。
  这种来自上面的污染肯定没问题。
  还可能是电泳液，
  但是电泳液污染就不会溴酚蓝分界这么清楚了。
  有可能没到溴酚蓝也可能超过。
  所以排除。
  从配溴酚蓝试一下。

• ending (2014-6-18 10:55:23)

  是新配的电泳缓冲液. 倒是配好放了几天再用的.
  ＝＝＝＝＝＝＝＝
  放几天没问题啊，最好放4度。
  常温放几天也没问题的
  另外最好加水浴啊，不加影响二向效果不说，玻璃板如果炸了不也是要破费银子和耽误实验进程吗？
  但你的问题不是二向温度所致的。

• ending (2014-6-18 10:55:45)

  
  如果遇到不好判断具体原因的情况时，
  保险起见都从新配，
  这是看似麻烦但属于磨刀不误砍柴工的有效的“笨”办法。
  比你绞尽脑汁的找原因，一项一项排除要好呢
  如果你非要找出明确的原因（如果有时间有兴趣的话Big Smile）
  可以用用排除法
  就是，
  1、你先配新的电泳液＋旧的琼脂糖，然后跑空白胶，不用跑完就染色。
  2、你用旧的电泳液＋新配的琼脂糖···············
  3、两者都用新的··················
  如果还有···········
  不应该有了···········哈哈！
  万一有呢·········
  万一有就再重新配配胶的液体，哈哈！（决不会的，呵······）
  祝你实验顺利～！

• fox_79 (2014-6-18 10:56:11)

  这次我偷懒了. 自己一厢情愿地认为是电泳缓冲液的问题. 该打! 看你的分析,忽然感觉自己又犯错了.Blush
  我原来是这么分析的: 因为琼脂糖凝胶是新配了,用第一次时没问题, 第二次(也就是上图这次)才出问题的. 所以排除琼脂糖的问题了.(现在想想好象不能完全排除这个原因的,汗)跟产热关系好像也不大.
  没有排除原因就往下做大通了.琼脂糖凝胶没换, 电泳缓冲液全换Bio-rad试剂配的, 保证恒温冷浴。（唉，如果是琼脂糖凝胶的问题，我死定了）
  准备这样排除原因：制两块空把白胶，一胶上填琼脂糖凝胶，一胶不填，在上次的缓冲液中进行电泳。银染看结果。如果全出现问题，那么是电泳缓冲液的问题，如果只有填了琼脂糖凝胶的出问题，那么结果也就知道了。
  上帝保佑我，千万不要是琼脂糖凝胶的问题。
  等银染结果出来再汇报！

• fox_79 (2014-6-18 10:56:56)

  是电泳缓冲液的问题。
  原来剩下的电泳缓冲液放了几天，发现溶液变的很粘稠，显微镜下看有像神经元细胞一样的丝状物漂浮着，估计是放室温（现在气温也高了）长真菌了。
  建议，配好的溶液暂时不用的话请放4度保存，特别是1*工作液。

• ending (2014-6-18 10:59:03)

  
  是电泳液的问题啊Oh My God
  判断失误Blush
  （唉，如果是琼脂糖凝胶的问题，我死定了）
  但是你的这次实验没被耽误了，恭喜呢SmileBig Smile
  谢谢反馈，但我原来遇到过的电泳液所致污染没有这么齐刷刷的呢，
  谢谢，又长知识了Big Smile
  及时反馈问题给大家提供经验和教训的热心战友也应该加分吧BlushBig Smile
  另外，配成5×的放置好像最稳定
  祝你实验顺利Smile

• fox_79 (2014-6-18 11:00:16)

  
  呵呵，是阿，5×母液放室温放这么1~2周估计问题也不大的。高盐状态下，能长的菌还是比较少的。
  不过还是听你的建议，母液也放4度保存比较保险。
  真的好感谢ending战友。