【求助】有关基因疫苗?

最新回复

• mamamiya (2014-6-18 16:38:05)

  
  (1)构建基因疫苗的载体能否用pEGFP的载体?如果不行,能否介绍一些商业化的免疫载体?
  可以借用用该载体作为对照，判断基因在体外表达的水平。常用的商业化载体有：pVAX1,pIRseno，pcDNA3.1等。
  (2)载体里面是否一定要有CPG序列?
  CPG序列对基因免疫有增强作用，但是非必需的。
  (3)基因疫苗进入机体内是先表达目的蛋白,再呈递抗原;还是肌体直接针对基因片断产生作用?(能否提供一定的资料)。
  这个目前尚有争论。一般说，基因进入体内后，主要是通过直接呈递抗原，产生免疫效应。

• 3648755 (2014-6-18 16:38:33)

  
  谢谢!
  pEGFP只能用来做体外表达的检测啊,那我惨了.要重新做了.
  在制备纯化的载体时,我使用PEG8000纯化,感觉做100ML的培养液得到的纯化产物还没有做少量提取的,有什么好的方法吗?我已经加了氯霉素了.
  另外,能否介绍一些有关基因免疫的的、比较基本的书籍呢?

• qqq111 (2014-6-18 16:38:54)

  
  1，疫苗中规定是不能有标记基因的，体外基础试验可以，而体内必须干净！
  2，根据经典免疫学原理，应该是基因在细胞内表达，MHC1提呈，诱导T细胞免疫，故个人认为是在protein level.

• youyou99 (2014-6-18 16:39:34)

  
  "疫苗中规定是不能有标记基因的",谢谢啊!我开始还以为有标记的基因如HIS,MYC之类的标记基因,一方面有利于检测,另外,也是一种异源蛋白更有利目的蛋白表达后产生抗原反应呢!能提供资料吗?
  那位战友有载体：pVAX1,pIRseno
  我有pEGFP-N1,pET 32a, pRSET a+,pET20载体交换

• youyou99 (2014-6-18 16:39:53)

  我想问一下,使用PEG8000纯化完成以后不是应该只有一条条带的吗?今天我又提了一次,量是上去了,可是既然出现了两条条带,不是应该全部是超螺旋吗?以下是我的操作方法Sad园内搜索到的)
  一种快速大量提取质粒的方法
  TB配制（500ml/瓶）
  bacto-tryptone 6 g，bacto-yeast extract 12 g，甘油2 ml，加H2O定容至450ml。
  磷酸缓冲液（100ml/瓶）:
  KH2PO4 2.31g，K2HPO4`3H2O 16.43 g，加H2O至总体积为100 ml。
  分开灭菌121℃湿热灭菌20min，待温度降至60℃后再加入50ml磷酸缓冲液，混匀。
  质粒抽提溶液（I,II,III,IV）
  Solution I配制（1000ml/瓶）
  Tris-HCl (pH8.0)Sad1M Tris-HCl pH8.0)50 ml，EDTA: (0.5M EDTA pH8.0)20 ml，加ddH2O定容至1000 ml。
  附：1M Tris-HCl (pH8.0)配制（500ml/瓶）
  Tris-base称量60.5g，加H2O400ml溶解，加入HCl 42ml后，继续用HCl调pH至8.0，加ddH2O定容至500ml。
  0.5M EDTA (pH8.0)配制（500ml/瓶）
  EDTA钠盐 93.06g、NaOH10g，加H2O400ml溶解，用1N NaOH调pH至8.0，最后定容至500ml。
  Solution II配制
  使用前新鲜配制：
  miniprep:200ul/管：10M NaOH 4 ul，10% SDS 20 ul，ddH2O176 ul。
  macroprep:10ml/管：10M NaOH 200 ul，10% SDS 1000 ul，ddH2O 8.8 ml。
  10M NaOH 配制：500ml (装于塑料瓶中) 称NaOH 200 g
  10% SDS 配制：500ml 称SDS 50 g（加热溶解）
  Solution III配制（1000ml/瓶）
  5M KAc 600 ml，冰醋酸115 ml，ddH2O 285 ml。
  Solution IV配制（200ml/瓶）
  NaCl 18.7g，PEG-6000称量26g，加ddH2O定容至200ml。
  TE 配制（500ml/瓶）
  Tris-HCl (1M Tris-HCl pH8.0)5ml，EDTA (0.5M EDTA pH8.0)1ml，加ddH2O定容至494ml。
  RTE配制（50ml/管）
  TE 49.5ml，分装好的RNase(10mg/ml) 0.5ml。
  实验步骤：
  1、接种200ul菌种于30ml 的TB中，37℃，300rpm的摇床中培养过夜；
  2、将菌倒入50ml的离心管，4℃离心10min，弃上清，加入5ml溶液I，剧烈震荡混匀；
  3、加入10ml溶液II，轻轻颠倒混匀；
  4、加入7.5ml的溶液III，混匀后4℃，4000rpm离心10min；
  5、上清通过两层纱布过滤到一洁净的50ml离心管中，然后加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后4℃，4000rpm离心15min；
  6、弃上清，沉淀中加入1ml含有0.1mg/ml的RNA酶的TE，放入37℃-55℃水浴30min；
  7、加入1ml 溶液IV，混匀后4℃，4000rpm离心15min；
  8、弃上清，沉淀加入0.4mlTE，溶解后加入等体积的酚/氯仿，混匀后室温12000rpm离心4min；
  9、将上清移入一新的洁净Eppendorf管中，用酚/氯仿重复抽提一次；
  10、上清中加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后室温12000rpm离心4min；
  11、沉淀用75%乙醇洗涤一遍，溶于0.2-0.4mlTE中，65℃放置10min，测定OD值。4℃冻存备用。

• c86v (2014-6-18 16:40:18)

  重要的是操作，还包括菌体发酵等问题。

• youyou99 (2014-6-18 16:40:38)

  我看了部分帖子,可是你们的帖子太多了,可否给一些具体的连接呢?
  还有我想重新设计引物构建基因疫苗的载体,请问应该如何添加KOZAK和CPG序列呢?应该有什么样的原则?
  在站内也看了一点但是还是不太明了请指教.
  谢谢!