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【求助】帮我分析分析我的奇怪结果
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我做的western blot,条件:12%的分离胶, 4%浓缩胶, bio-rad电泳仪, 恒压150v, 约1小时; 侵入式电转移, PVDF膜, 电压100v, 300mA, 1.5小时; 5%脱脂奶粉封闭1.5小时, 1:1000一抗4度孵育过夜, 1:1000二抗孵育1.5小时; Lumiglo发光, 曝光1分钟, 显影1分钟, 定影10分钟. 图象出来了: 我的目的带为40-50之间, 但50-60之间每个样本都有一强的条带, 不知是什么, 问了几个人, 也不清楚, 现求助丁香圆内高手, 希望尽快得到答案哦, 谢谢了.(我没有加actin的抗体, 故已排除actin的可能)
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最新回复
glass (2014-6-18 17:38:34)
小糖块 (2014-6-18 17:39:05)
QUOTE:
b-actin是42KD,根本不会在50-60kd处有这么浓密的条带
你的程序没问题
你做了几遍? 如果每次做都有这么一条强带的话,估计是一抗的特异性问题,与另一种蛋白也能发生非特异性结合。封闭是封闭不住显色这么强的条带的。
ququer787 (2014-6-18 17:39:40)
moonlight45 (2014-6-18 17:40:01)
QUOTE:
IgG的重链大约50kDququer787 (2014-6-18 17:40:21)
请教
moonlight45 (2014-6-18 17:40:39)
看你跑电泳的条件啦,还原的就会解链,重链和轻链分开;非还原的就可以看到完整IgG的条带。这些是在PAGE中可以看到,最后能否呈现在western blot的膜上,还要看你的一抗具体是抗抗原的什么部位。
=pkchen= (2014-6-18 17:40:57)
你可以把封闭时间减小到1h
但是这样的话,可能带就不清晰了
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