【求助】蛋白电泳图

最新回复

• vvmmoy (2014-6-18 17:54:01)

  
  上样量是多少，好像看上去上多了
  有没有加蛋白酶抑制剂？
  离心得转速是多少？是不是离心的速度不够大，时间不够长？

• yychen (2014-6-18 17:54:25)

  
  银染时间过长。
  背景颜色深可能是胶上沾了杂质，尽量不要用手接触。
  上样量偏大

• 12xunmei (2014-6-18 17:54:58)

  QUOTE:

  原帖由 vvmmoy 于 2014-6-18 17:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  上样量是多少，好像看上去上多了
  有没有加蛋白酶抑制剂？
  离心得转速是多少？是不是离心的速度不够大，时间不够长？

  上样量50微克，蛋白酶抑制剂也加了
  4万g离心，40分钟

• 12xunmei (2014-6-18 17:55:21)

  QUOTE:

  原帖由 yychen 于 2014-6-18 17:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  银染时间过长。
  背景颜色深可能是胶上沾了杂质，尽量不要用手接触。
  上样量偏大

  银染为4分钟
  胶上确实有杂质，但如何才能不用手接触胶啊
  银染容器应该用什么，一般的好像都是自制的吧
  您是怎么做的呢

• yychen (2014-6-18 17:55:36)

  银染没有固定时间，看显色程度可以就应该停止了。
  在倒液体时，尽量和胶接触面小，可以用手指固定一角，慢慢到出液体。有一种槽子，本身有出水口，这样就避免用手接触了。

• memory (2014-6-18 17:55:56)

  
  看你的上样量和离心都没有什么问题，是不是跟你的样品有关系？
  我猜想精子的成分比较复杂，脂质比较多，还有精液会不会也夹杂在你的提取液中呢？

• 12xunmei (2014-6-18 17:56:13)

  
  精子的成分确实比较复杂，但是精液不会在提取液中，因为进行了二步提取

• memory (2014-6-18 17:56:56)

  
  背景颜色深可能跟你用的水和银染试剂有关系。水最好是miliq的超纯水，试剂中不能有杂质，都用分析纯的。
  银染的时候带手套就好了啊，容器用玻璃器皿就好了，我们组盛胶的是办公用的抽屉，塑料的，比较好用。
  还有你可以尝试下加大cleanup试剂的用量，如果样品中核酸，脂质成分多的话会堵塞SDS－PAGE的孔径，然后蛋白没有办法分开，就扎堆成糊状了

• 12xunmei (2014-6-18 17:57:19)

  水是miliq的超纯水，试剂中都用分析纯的，都是进口的
  不知道北京哪里能买到办公用的抽屉，您位置是否在北京，能否告知具体地址我们已经买了很久，但没有买到合适的抽屉
  样品经cleanup提取后用超声处理过，不应再有核酸
  不知脂质成分如何能够去除？

• memory (2014-6-18 17:58:24)

  我在上海，抽屉是在超市买的。
  下次你加大cleanup试剂的用量试试看吧，延长离心的时间到一小时，

• orangecake (2014-6-18 17:58:42)

  请问你4万转离心是超离吗？我们学校4万转离心最少的量都是5ML，而一般的离心机最高只能达到14000转，请教！
  还有，弱弱地问一句，4万转离心会把蛋白离下来吗？

• tangxin_80 (2014-6-18 17:59:02)

  
  提两点楼上几位都没有提到的可能的原因:
  1.转二向时胶条没有放置好,可能会产生斑点的重影.
  2.PAGE胶聚合不均匀,灌胶时没有漏的可能性吧,聚合不能太快,可以适当减少APS 或TEMED的量或浓度.
  楼主好运!

• remonte (2014-6-18 17:59:26)

  
  1.检查Tris的PH,最好用2个PH计校准
  2.银染不要污染,一定要用Milli Q水,电阻要>18.2M欧姆!(你的Milli Q水仪器是否长时间没更换柱子了?)