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【求助】蛋白纯化
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我要纯化一个蛋白，没有标签，破细胞取上清，通过盐析后电泳检测目的蛋白约占30%左右，后上分子筛，现在的问题是洗脱峰就一个，电泳发现我的目的蛋白和杂蛋白都一起出来的，为什么呢？有人解释说可能是目的蛋白和杂蛋白结合在一起了，比如形成了跨膜结构等，不知道大家做蛋白纯化时有没有出现过这种情况。我将溶液pH调至10左右，目的是要尽量打开肽链，后过分子筛，结果还是一样。
请问各位大虾有无高见？
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最新回复
lxh031 (2014-6-19 13:28:05)
用分子筛关键在于你的蛋白和杂蛋白分子量的差距，一般至少需要2－3倍才可以用分子筛。另外要考虑所用凝胶的截流范围、走内水还是走外水等因素。
凝胶过滤就一个峰，说明不能起到分离效果。另外，pH10容易引起蛋白失活甚至变性，通过凝胶过滤并不适合纯化。你可以考虑用离子交换和疏水层析来做。
TNT (2014-6-19 13:28:32)
谢谢您的回复。
我的目的蛋白分子量11kd，几个主要的杂蛋白都在30-70kd，分子量相差悬殊，并且我用的superdex75的柱子，可分离范围在3kd-70kd，所以我想您说的上面的情况都不是问题。
如果目的蛋白嵌合入杂蛋白，我是希望通过变性来达到将其分开的目的，但现在看来好像仍然分不开。
您说的离子交换和疏水层析又怎样将杂蛋白和目的蛋白分开呢？
mysmdbl (2014-6-19 13:28:59)
你这个蛋白是用大肠杆菌表达的吧.如果是,我怀疑你的目的蛋白或许和DNA或RNA形成了复合物,这样的话,你用分子筛分离是得不到好的分离效果的.你可以用DNase 处理一下在分离,看有没有效果.
也可以查文献,了解这种蛋白的C端有没有一个和核酸结合的位点.
ritou1985 (2014-6-19 13:29:27)
QUOTE:
离子交换是利用蛋白质等电点的不同，在一定pH条件下，蛋白荷电性质的差异，与凝胶结合作用的差异，因此可以通过不同离子强度的缓冲液来洗脱和分离。疏水层析是根据蛋白质与凝胶的疏水性质来分离纯化的，具体的方法有很多资料可以查阅，当然也要尽可能了解你的蛋白性质。
这两种方法是分离没有亲和标签的蛋白最通用的方法。
凝胶过滤虽然简单，但并不实用，有很多缺陷，耗时长、上样量少，最主要的是分离效果并不理想，一般情况下是不采用凝胶过滤的。
根据你的情况，如果对产物含量要求不高的话，可以把分子筛的范围在缩小一些，让杂蛋白走外水，目标蛋白走内水，应该可以改善。
98776langtao (2014-6-19 13:29:59)
QUOTE:
就你的目的蛋白和杂蛋白的分子量而言，用superdex-G75分不开，若70kda和11KDa能勉强分开的话，那么30kda和11kda根本就分不开，我以前做过类似实验。如果一定要用凝胶柱，就选G50或G30的，最好在过凝胶柱之前过一个离子柱。TNT (2014-6-19 13:30:40)
QUOTE:
用superdex-G75分不开，若70kda和11KDa能勉强分开的话，那么30kda和11kda根本就分不开，从这个柱子的参数来看完全可以将他们分开的吧
18663530.jpg
8princess8 (2014-6-19 13:31:14)
那些柱子用的是１３微米的填料，而你用的是３４的，分辨率差多了，所以没办法和预装柱比的，此外实验只参考，并非他做的你的就一定能分开：）建议别把全部指望都放在凝胶柱上．
TNT (2014-6-19 13:31:56)
该蛋白前后经过近一个月的努力，终于纯化出来了，结果很好，AKTA最终出现了理想中漂亮的分离峰，经鉴定，我的目的蛋白就在第二峰，纯度在95%以上，特发此帖做个圆满的结束，也多谢各路大虾相助！
lxh031 (2014-6-19 13:32:16)
我也很想知道楼主解决的办法，希望楼主能把经验和大家分享
TNT (2014-6-19 13:32:37)
各位不好意思，前段时间比较忙没有上来，所以大家的问题没能及时回复。现在我就简单说一下我的纯化思路吧，每个蛋白不同，纯化方法各异，希望对大家有点帮助。
前面大家也看到了我一开始是用细胞裂解上清，硫酸铵粗沉，后上AKTA，实际上结果很不理想，目的蛋白与杂蛋白总是同时被洗脱了下来，怀疑目的蛋白与与大分子杂蛋白等结合在一起形成了复合物。后来改变思路，假如情况如我猜测的那样，那么如果用变性剂处理，打散肽链，再过分子筛应该能够得到理想的结果。于是，我的实验操作如下：
大肠杆菌表达----破细胞收获裂解沉淀（当然要通过跑胶检测目的蛋白分布确定目的蛋白大部分以包涵体的形式存在于沉淀中）----包涵体洗涤沉淀两三次（低浓度尿素或盐酸胍，或Tris,EDTA,Triton-X100等自配的包涵体洗涤液）----8M尿素溶解-----AKTA层析（流动相20mM PBS,0.15M NaCL）
分管收集洗脱峰可得到目的蛋白。结果证明该方法效果很好，纯度大于95%。
欢迎各路大虾发表意见，交流心得。
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