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【求助】为什么我15％的胶跑得这么恐怖啊？
15%分离胶，4％浓缩胶，Tris-Glycine-SDS体系，【求助】为什么我15％的胶跑得这么恐怖啊？
30ug蛋白上样量，50ul体积。
0.03A恒流，溴酚蓝跑至底部时，20kd的那道marker还在胶的中间。
箭头标注的条带就是目的条带（17KD）。
在积层胶那部分跑起来还是很正常的，可是到了分离胶就不行了。
溴酚蓝变成很宽的弥散状，下缘是平的，可是上缘弯弯曲曲，丑得不行。
为什么跑出来会这样歪歪扭扭的呢？
是因为上样量太大？可是我以前跑10％的胶，60ug上样量都不会跑成这个样子啊。
已经排除了配胶试剂和电泳液电泳设备的问题。
请大家帮忙分析分析，拜谢~
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最新回复
ritou1985 (2014-6-20 15:25:52)
如果不是试剂问题，那只能是样品问题了。
JK.jon (2014-6-20 15:26:19)
样品一般会有什么问题呢？
是上样量过大么？
因为是显内源的蛋白，所以上了30ug
按理来说，这个上样量不算大呀
我用的是BIO-RAD的电泳仪，1.5cm，10孔的，最多可以上80ul的量，我上50ul也不算特别多啊
虽然试剂没问题，但是实验条件也许有一些不足之处
比如电压啊
是不是应该放4度电泳啊之类的
比如吧2*的loading buffer换成4*loading buffer会不会好一些呢？
比如换成5％的浓缩胶或者浓缩胶的长度弄长一些会不会对跑胶效果有影响？
我不知道跑成上面这种样子的条带一般是什么原因造成的，所以很希望有经验的战友给予指点，我也好相应的改进实验条件
有没有谁比较有跑15％胶的心得体会呀
JK.jon (2014-6-20 15:26:35)
难道都是因为上样量太大的原因么？
而且内源都是兔二抗，显出来条带都很不sharp
唉
nut6694 (2014-6-20 15:29:48)
summerxx (2014-6-20 15:30:16)
是不是4度电泳不是一个很严格的因素。
从你的电泳图上看，感觉像胶凝得不是很均匀，不知道你作胶的时候感觉胶凝的状态如何
浓缩胶可以适当的长一些也会对你的电泳有所改善，另外，你是恒流电泳的，我一般是恒压，浓缩胶跑100v，大概5-7min，进入分离胶后，恒压150v，跑出来的效果感觉不错
JK.jon (2014-6-20 15:30:40)
怎么样才可以使胶凝得比较均匀呢？
tuuu2 (2014-6-20 15:32:22)
把你的电泳缓冲液重配一下,不是盐离子浓度大了(也可能上下槽液重复使用次数太多导致)就是PH值不对。另外注意电泳时电压电流不要太大.
zzzz (2014-6-20 15:32:41)
我在想有没有可能是你丙烯酰胺没有过滤？
小野花 (2014-6-20 15:33:17)
JK.jon (2014-6-20 15:33:46)
从你的电泳图上看，感觉像胶凝得不是很均匀，不知道你作胶的时候感觉胶凝的状态如何
浓缩胶可以适当的长一些也会对你的电泳有所改善，另外，你是恒流电泳的，我一般是恒压，浓缩胶跑100v，大概5-7min，进入分离胶后，恒压150v，跑出来的效果感觉不错
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电泳液的温度很重要吧？
我查了《蛋白质电泳实验技术》里面，说“电泳时电流产生的热是大部分电泳方法的主要问题。即使使用冷却装置，也会仍然在凝胶中产生温度差异。这种温度差异导致相同分子在凝胶的不同部位会有不同的迁移速度，而是蛋白带产生弯曲畸变。”
我以前也是用恒压跑的，但是上层胶都要跑20min左右啊
你跑100V的时候电流多大呀？如果是两块胶一起跑的话？
JK.jon (2014-6-20 15:34:03)
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电泳液是新配的
跟这板15%一起跑的还有一板10%的胶
10%的那一板跑得非常漂亮
说明电泳液啊电泳仪器什么应该都没什么问题...
另外，电泳液还要调pH么？
JK.jon (2014-6-20 15:34:25)
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都有过滤的
而且同样的acry配其他低浓度的胶都很正常
JK.jon (2014-6-20 15:34:41)
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这个是什么原理呢？
summerxx (2014-6-20 15:35:14)
跟这板15%一起跑的还有一板10%的胶
10%的那一板跑得非常漂亮
说明电泳液啊电泳仪器什么应该都没什么问题...
另外，电泳液还要调pH么？
......
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电泳液是需要调PH的，大概8.3，如果你是按照分子克隆上的配方配出来的应该大致相当，你测一下试试！
linlinstar (2014-6-20 15:35:43)
溴芬兰弥散正常，因为你的上样量太大（体积），试着提高你的蛋白浓度，上样量一般不要超过30微升，这样的话，跑的胶非常漂亮，
还有，你的电泳电流，我一般用80伏的恒压跑，非常好。
JK.jon (2014-6-20 15:36:03)
今天又跑了一次电泳
把可能存在的问题都排除了
可是结果还是跑得乱七八糟，跟上次的一样
这次的上样量是25ug，25ul左右（减少了近一半的上样量，没有超过xinghan88说的30ul。但是还是和上一次一样，刚进入分离胶的时候溴酚兰压得很细，跑到分离胶的越1/3就开始越来越纵向弥散，我觉得这种弥散跟以前上样量太大导致的溴酚兰压不细是两个完全不同的现象）。
浓缩胶换成了5%（和4%浓缩胶一样，跑得都挺正常的，到分离胶才不行）
浓缩胶的长度也增长了
不过我的浓缩胶100V一般都要跑半个小时的，不晓得kangpingw为什么100V只要7min就行？
检查过胶，没有气泡。
好痛苦啊
救命啊
或者换成12%的胶会不会跑得好看一点呢？
moonlight45 (2014-6-20 15:40:53)
总结一下大家的回答，也是我的一点点看法：
1.制胶的问题：严格按照分子克隆上的配方配制浓缩及分离胶。在各组分的液体中，我感觉很重要的是TRIS－CL的配置，不同的浓度，不同的PH值，一定要正确。胶的浓度大些，跑的条带会 好看些，但电泳的时间及电转的时间都会增加。另外 在聚合时间上，一般现在的温度（20度），至少在30分钟以上。
2.上样量不算大，但体积不要太大。办法是：使用浓一些的样品，上样缓冲液可以配成5x的。这样条带会好看一些。
3.电泳时间不是很大问题。因为其取决于你的电压大小，一般均采用恒压，电压越大，产热会多，因此，最好在冰盒内电泳（如果由制冰机的话，不是问题。）但我的感觉是，电压不要太大，在80-100v，跑得时间长一些，结果会好看些。我曾经染过电泳后的胶，确实是这样。
另外，电泳缓冲液很重要，按分子克隆的配方配制，配成5x的储存液，每次使用时稀释到1x的工作液，工作液最多使用2次，也就是说，第一次是新鲜配的，用完后回收，再用一次就弃掉，不要反复用，因为其中的离子浓度已经今非昔比了。注意：配制液体时一般要配成储存液，这样存放时间较长也会比较稳定，而且经用，如果配成工作液，不能长时间存放，且一次配成用不了几次又需要配了，很麻烦。
综上，
1.请按照分子克隆检视自己所配的液体是否合适；－－关键！
2.使胶聚合充分；
3.冰盒中电泳，电压、时间中庸一些，别片面追求时间短。
祝试验成功！
moonlight45 (2014-6-20 15:41:20)
把可能存在的问题都排除了
可是结果还是跑得乱七八糟，跟上次的一样
这次的上样量是25ug，25ul左右（减少了近一半的上样量，没有超过xinghan88说的30ul。但是还是和上一次一样，刚进入分离胶的时候溴酚兰压得很细，跑到分离胶的越1/3就开始越来越纵向弥散，我觉得这种弥散跟以前上样量太大导致的溴酚兰压不细是两个完全不同的现象）。
浓缩胶换成了5%（和4%浓缩胶一样，跑得都挺正常的，到分离胶才不行）
浓缩胶的长度也增长了
不过我的浓缩胶100V一般都要跑半个小时的，不晓得kangpingw为什么100V只要7min就行？
检查过胶，没有气泡。
好痛苦啊
救命啊
或者换成12%的胶会不会跑得好看一点呢？
......
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我怀疑胶和玻璃板之间有缝隙。我跑了两块10％的，其中一块，出现了异常。但也只是其中几个条带出现了快速下移。
请问：分离胶的灌胶之后，你用什么压的胶，如果是水的话，换成*醇试试（记不得了，查分子克隆）。我有一次用10％的SDS压的胶（应该是0.1％的SDS），结果胶聚合的不均匀。
另外，检查一下配胶时，SDS的用量和浓度是否正确。是否充分混匀，是否用错缓冲液，过硫酸铵和TEMED是否是最后加入的。用量是否不对（有人和我说过，分子克隆的这两个试剂有可能不对，我没有验证过）。玻璃板是否洗净。和周围跑过15％的人对比一下配胶和步骤。
从结果看，是蛋白泳动的不均匀。可能是胶的问题，也可能是胶底部微小的气泡造成。
我怀疑还是胶的聚合不均匀。可能是凝胶的时间不够，也可能是过硫酸铵和TEMED用量问题，或者未充分混匀。也可能是SDS的过量。4度电泳试试。恒压试试。
哦，对了，拔掉梳子后，有没有冲洗一下上样孔？
sunnyB (2014-6-20 15:41:40)
0.03A恒流，溴酚蓝跑至底部时，20kd的那道marker还在胶的中间。
箭头标注的条带就是目的条带（17KD）。
在积层胶那部分跑起来还是很正常的，可是到了分离胶就不行了。
溴酚蓝变成很宽的弥散状，下缘是平的，可是上缘弯弯曲曲，丑得不行。
为什么跑出来会这样歪歪扭扭的呢？
是因为上样量太大？可是我以前跑10％的胶，60ug上样量都不会跑成这个样子啊。
已经排除了配胶试剂和电泳液电泳设备的问题。
请大家帮忙分析分析，拜谢~
不知道你配的30％丙烯酰氨的PH质调过了吗？你的电泳缓冲液重新配，并注意它的PH质
bring (2014-6-20 15:58:05)
个人以为：
1. 上样量不大，30ug可以，但体积不要超过加样槽的容积。
2.电泳时恒流0.03A有点高，试试20mA吧。
3.注意降温，冷却。
4.用新的过硫酸铵。
5.所有用到的溶液要过滤。最好用高纯水。
【求助】为什么我15％的胶跑得这么恐怖啊？