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【求助】丙酮沉淀蛋白问题
【求助】丙酮沉淀蛋白问题
最近做丙酮沉淀蛋白。过程如下:目的蛋白4ml(溶解于pbs 缓冲液ph7.4中)在搅拌下加入10ml -20度预冷的丙酮(终浓度约70%),-20度沉淀过夜第二天离心,沉淀中很多盐也一起沉淀下来了。
而我上次用丙酮沉淀含100mM的NACL的该蛋白时候却没有沉淀阿 ?不过上次蛋白量比较少
不知道是不是丙酮沉淀时盐也会一起沉淀(我的NACL 137mM)?丙酮沉淀是不是有浓度限制还是有绝对的量的限制呢?请高人指点!
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最新回复
one (2014-6-20 16:46:11)
一般丙酮沉淀用量是蛋白液体量的4倍。也就是说你4ml样品,需要加16 ml的丙酮。
另外,低温沉淀会导致盐共沉淀的。你可以试试在室温下沉淀2小时。
PCR (2014-6-20 16:46:34)
室温沉淀容易导致蛋白的变性啊.我用4ml蛋白加10ml丙酮可以沉淀蛋白.不过不知道回收率.不过我感觉大部分能沉淀下来吧!您认为丙酮沉淀盐的时候是跟盐浓度关系大还是跟盐的量(当然在能沉淀出来的最小浓度之上了)关系大呢?
我上次沉淀含0.1M NaCl .20mM Tris.cl pH8.0的时候500ul 加1.25ml丙酮沉淀过夜就没有沉淀下来.这次4ml蛋白(在PBS缓冲液中:137mM NaCL 10mM Na2HPO4 2.7 mM KCl 2mM KH2PO4 pH7.4)加10ml丙酮为什么就沉下来了啊?
蒲公英 (2014-6-20 16:46:57)
丙酮可以用透析的方法出去么??
PCR (2014-6-20 16:47:15)
用透析那还不如用离心倒掉来得快啊!
不知道您说的透析是怎么操作的?
xyw5 (2014-6-20 16:47:50)
用透析那还不如用离心倒掉来得快啊!
不知道您说的透析是怎么操作的?
PCR (2014-6-20 16:48:11)
我沉淀的蛋白是多肽。只有5kd
应该还好。沉淀的蛋白用水可以溶解一半左右。剩下的还是没有办法溶解。你一般用什么浓缩阿?用PEG怎么样啊?我的不能用浓缩管。太小了。比较危险啊。硫酸铵沉淀还得除盐,而且小肽硫酸铵沉淀也不知道效果怎么样啊?。损失可能也大
vvmmoy (2014-6-20 16:48:27)
你的蛋白太小了,用超滤浓缩管不是很好做。要是丙酮不会引起你的蛋白变性,还是不错的方法。终浓度70%的丙酮效果还是不错的,引起盐沉淀的原因可能是你的沉淀时间太长了,减少时间会好些。2h,-20度基本上就够了。
PCR (2014-6-20 16:48:45)
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